MMP13在關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達及RNAi對其抑制作用的實驗研究.pdf

1、本文分四部分論述了MMP13在關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達及RNAi對其抑制作用的實驗研究?！　〉谝徊糠郑捍笫笞魟┬躁P(guān)節(jié)炎模型中MMP3、MMP9、MMPl3及TIMP一1的mRNA表達。 研究目的：研究大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型中爪部跖趾關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)的軟骨及滑膜中的MMP3、MMP9、MMPl3及TIMP-l在不同時期的表達情況。 研究方法：制作大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型25只，分別于造模第1，2，5，7，9周各處死5只。取注射足(患爪)

2、的跖趾關(guān)節(jié)和同側(cè)膝關(guān)節(jié)的軟骨及鄰近滑膜，用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法檢測MMP3、MMP9、MMPl3及TIMP-l的mRNA表達，同時取患側(cè)爪部跖趾關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)軟骨行病理切片檢查。 研究結(jié)果：造模第l、2周，患爪的軟骨及滑膜中MMP3、MMPl3均有表達，且在第1周，MMP3相對表達水平較MMPl3高，第5周MMP3尚有表達，MMPl3未測到表達，第7周MMP3，MMPl3均無表達。患爪滑膜及軟骨中TIMP-1直

3、到第7周才測到表達,MMP9表達不穩(wěn)定。膝關(guān)節(jié)可以測到TIMP一1，各時間段均未測到MMP3、MMP9及MMPl3的表達。病理光鏡下第9周患爪部跖趾關(guān)節(jié)滑膜可見炎性反應(yīng)，患爪和膝關(guān)節(jié)的軟骨無明顯改變。 研究結(jié)論：在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型早期，患爪的跖趾關(guān)節(jié)滑膜和軟骨可以檢測到MMP3，MMPl3的持續(xù)表達，后期TIMP-1表達上升，推測MMP-TIMPl的平衡關(guān)系紊亂可能在軟骨破壞過程中起重要作用。但是患爪和膝關(guān)節(jié)無骨組織、軟骨破

4、壞，說明MMP對軟骨膠原及基質(zhì)的降解是一個長期過程。 第二部分MMPl3在兔膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中表達的實驗研究。 研究目的：觀察在兔膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)軟骨細胞中是否有MMPl3、II型膠原、X型膠原以及aggrecan的mRNA和MMPl3的蛋白表達。 研究方法：將5只大白兔行單側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切除術(shù)(anteriorcruciateligamenttran

5、section．ACLT)并摘除內(nèi)側(cè)半月板，對側(cè)行假手術(shù)，在第二周處死，大體觀察后，取膝關(guān)節(jié)滑膜組織培養(yǎng)滑膜細胞，另取部分手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨做透射電鏡檢查，剩余軟骨消化后，用RT-PCR和免疫組化法檢測軟骨細胞中的aggrecan、MMPl3、II型膠原、X型膠原的mRNA和MMPl3的蛋白表達。 研究結(jié)果：造模兩周后大體觀察見膝關(guān)節(jié)軟骨破壞，透射電鏡下可見軟骨細胞細胞器溶解，膠原纖維網(wǎng)稀疏?；ぜ毎茨軌騻鞔囵B(yǎng)。手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)軟

6、骨細胞可檢測到II型膠原、aggracan和MMPl3的mRNA，X型膠原無表達。免疫組化法MMPl3蛋白的表達陽性，假手術(shù)側(cè)無MMPl3和蛋白的表達。 研究結(jié)論：第二周時兔膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性骨性關(guān)節(jié)炎模型軟骨細胞中有II型膠原、aggrecan和MMPl3的mRNA表達。軟骨細胞中有MMPl3蛋白表達。 第三部分MMPl3在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細胞中表達的研究。 研究目的：觀察在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者(osteoarth

7、ritis，OA)的滑膜細胞中是否有基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrixmetalloproteinases-13，MMPl3)的mRNA的表達。 研究方法：取臨床上確診為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的患者的滑液培養(yǎng)滑膜細胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫組化法鑒定其為成纖維細胞后，用RT-PCR檢測其中MMPl3的mRNA表達。 研究結(jié)果：所培養(yǎng)的細胞呈成纖維細胞樣，Vimentin蛋白表達陽性，RT-PCR可檢測到MMPl3的mRNA表達，片斷大小

8、和引物設(shè)計相一致。 研究結(jié)論：骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細胞中有MMPl3的mRNA表達。 第四部分RNAi抑制兔創(chuàng)傷性骨性關(guān)節(jié)炎中MMPB表達的實驗研究。 研究目的：觀察RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)是否能有效抑制兔OA模型膝關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrixmetalloproteinases-13，MMPl3)的表達。 研究方法：體外化學(xué)合成MMPl3序列特異性雙鏈RNA

9、與脂質(zhì)體混合后轉(zhuǎn)染OA模型中的軟骨細胞，實驗分四組，特異性siRNA組：特異性siRNA+Lipofectamine2000：非特異siRNA組：非特異性siRNA+Lipofectamine2000；脂質(zhì)體組：Lipofectamine2000；對照組：無血清DMEM。用RT-PCR和免疫組化法檢測抑制軟骨細胞中的MMPl3的表達。MTT法檢測各組的軟骨細胞生長情況。 研究結(jié)果：RT-PCR顯示siRNA組較對照組、非特異性組