P162抑制Hedgehog信號轉(zhuǎn)錄因子Gli-1增強(qiáng)食管癌Eca109細(xì)胞的放射敏感性.pdf

1、目的:探討靶向G3BP(RasGAP結(jié)合蛋白)新藥多肽P162是否通過抑制Hedgehog信號轉(zhuǎn)錄因子Gli-1對人食管癌細(xì)胞株Eca109起放射增敏作用
　　方法:1.多次反復(fù)以8Gy劑量X線(總共累計(jì)60 Gy)照射食管癌Eca109細(xì)胞誘導(dǎo)Eca109R細(xì)胞;
　　2.采用CCK8法測Eca109及Eca109R細(xì)胞在0、2、4、6、8Gy下增殖抑制率,比較兩者之間的差異;
　　3.免疫細(xì)胞化學(xué)法、免疫熒光技術(shù)測

2、Gli-1在Eca109及Eca109R細(xì)胞內(nèi)表達(dá);
　　4. HE染色觀察20μmol/L P162作用48小時后Eca109及Eca109R細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;
　　5. Western blot測照射后Eca109細(xì)胞在1、2、4、24、48、72 h、7、10、14、18d時間點(diǎn)核內(nèi)Gli-1表達(dá),以未照射Eca109細(xì)胞為對照;Western blot測照射后Eca109R細(xì)胞在48h時間點(diǎn)核內(nèi)Gli-1表達(dá),以未照射

3、Eca109R細(xì)胞為對照;
　　6. Western blot測處理組細(xì)胞核內(nèi)Gli-1表達(dá):處理組給予兩種干預(yù)方法,先20μmol/L P162干預(yù)48 h,后6 Gy照射,分為四組,即:未照射不加藥組、未照射加藥組、照射加藥組和照射不加藥組,每組均含Eca109、Eca109R兩種細(xì)胞。
　　7.流式細(xì)胞儀測處理組細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:1.在相同的照射劑量及相同時間下, Eca109R細(xì)胞增殖抑制率明顯低于Eca

4、109細(xì)胞;
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示Eca109、Eca109 R細(xì)胞中胞核、胞漿均表達(dá)蛋白 Gli-1,兩者免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度分別為:1.05629±0.098,1.703975±0.055(P<0.05),免疫熒光陽性細(xì)胞率分別為:39.9567±0.0097％,66.4589±0.0251%(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示Eca109較Eca109R細(xì)胞低表達(dá)核內(nèi)蛋白Gli-1;
　　3.

5、 HE染色結(jié)果:未處理的Eca109細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則多邊形,如鋪路石排列,Eca109R細(xì)胞呈不規(guī)則梭型,不規(guī)則排列。經(jīng)20μmol/L P162處理48 h后的Eca109細(xì)胞皺縮聚集,變?yōu)椴灰?guī)則條形,可見細(xì)胞裂解相互融合,Eca109R細(xì)胞亦表現(xiàn)為皺縮聚集,可見核縮小、多核,細(xì)胞裂解融合。
　　4. Western blot測放療后Eca109細(xì)胞在1、2、4、24、48、72 h、7、10、14 d、18d時間點(diǎn)核內(nèi)Gli

6、-1表達(dá),結(jié)果顯示:照射后核蛋白Gli-1逐漸下調(diào),與control(未照射Eca109細(xì)胞)相比,第48h表達(dá)最低(P<0.05),此后逐漸上調(diào),第14d表達(dá)最高(P<0.05),18 d趨于下降趨勢;與照射前相比,Eca109R細(xì)胞照射后48 h核內(nèi)蛋白Gli-1下調(diào)。
　　5. Western blot測照射及P162處理后Eca109、Eca109R細(xì)胞核內(nèi)Gli-1表達(dá)變化:未照射加藥組較未照射不加藥組低表達(dá) Gli-1

7、,其中未照射不加藥組中, Eca109R較Eca109高表達(dá)Gli-1(F=135.73, P<0.0001);照射加藥組較照射不加藥組(照射后2、14 d)低表達(dá)Gli-1,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中照射不加藥組(照射后2、14 d)中, Eca109與Eca109R的Gli-1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[分別為F=1.89, P=0.2064(2 d), F=0.45,P=0.5191(14 d)].
　　結(jié)論:Hh信號轉(zhuǎn)