HarpinEcc蛋白對(duì)園藝植物的生物學(xué)效應(yīng)及其誘導(dǎo)抗性的分子機(jī)制解析.pdf

1、本研究的目的是從國(guó)內(nèi)患軟腐病的作物中分離Erwiniachrysanthemi和Erwiniacarotovorasubsp.Carotovora菌，克隆并表達(dá)hrpN基因，研究其分子特性、遺傳多樣性及其對(duì)生物學(xué)效應(yīng)的影響，并對(duì)harpinEcc蛋白的理化特性、在園藝植物上的生物學(xué)效應(yīng)、過敏反應(yīng)的程度與對(duì)園藝作物的生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)系以及harpinEcc蛋白誘導(dǎo)植物抗性的分子機(jī)制等問題進(jìn)行研究，旨在進(jìn)一步豐富植物-病原菌激發(fā)子相互作用的研

2、究?jī)?nèi)容，同時(shí)為探討利用harpinEcc蛋白開發(fā)生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。 1，通過構(gòu)建ErwiniachrysanthemiCSCL006菌株的DNA文庫(kù)，克隆出CSCL006的hrpNEch基因，該基因全長(zhǎng)1020bp，G+C含量57.16﹪，編碼339個(gè)氨基酸，其中甘氨酸含量最高，為15.93﹪，推導(dǎo)的蛋白等電點(diǎn)(pI)為6.07，分子量(Mw)為34.1kDa,GenBank登錄號(hào)為AY999000。氨基酸序列比較表明該基因

3、編碼的harpinEch與ErwiniachrysanthemiEC16和3937編碼的harpin蛋白同源性高，但與Erwiniacarotovorasubspecies的harpin蛋白同源性較低。將CSCL006的hrpNEch基因克隆到表達(dá)載體pET28a(+)，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，高效表達(dá)出分子量為34Kda的蛋白，與預(yù)期大小一致，以抗harpinEcc的抗體為探針做Westernblot，證實(shí)該蛋白確為harpin蛋白，并能引起煙

4、葉的過敏反應(yīng)。 2.對(duì)從國(guó)內(nèi)患軟腐病的作物中分離鑒定出的Erwiniacarotovorasubsp.CarotovoraCSDS001和CSDS008菌株，用半定量平板法檢測(cè)了CSDS001和CSDS008菌株的果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和纖維素酶活性，兩個(gè)菌株均能產(chǎn)生上述四種胞外酶，但CSDS001胞外酶的活性明顯高于CSDS008；兩個(gè)菌株均能在48h內(nèi)引起歐芹軟腐病癥，CSDS001引起的病斑明顯較CSDS008大

5、；二者的菌體均能引起煙草出現(xiàn)典型的HR，這與野生型的Erwiniacarotovorasubsp.CarotovoraEcc71明顯不同。通過構(gòu)建DNA文庫(kù)分別從CSDS001和CSDS008中克隆到hrpN基因，CSDS001和CSDS008的hrpN基因編碼區(qū)長(zhǎng)度均為1068bp，GenBank登錄號(hào)分別為AY939927和AY999004。推導(dǎo)的CSDS001、CSDS008和Ecc71的hrpN基因編碼356個(gè)氨基酸。但與Ecc

6、71相比，harpinCSDS001有6個(gè)氨基酸不同，harpinCSDS008有4個(gè)氨基酸不同；harpinCSDS001和harpinCSDS008相比僅有2個(gè)氨基酸差異，即CSDS001的113位氨基酸為S，CSDS008為G，CSDS001的352位氨基酸為Q，CSDS008為K。對(duì)3個(gè)菌株的harpinEcc蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，harpinCSDS001的高級(jí)結(jié)構(gòu)與CSDS008和Ecc71有較大的差別，主要體現(xiàn)在a螺旋和

7、β折疊、Tum區(qū)、Coil區(qū)及抗原指數(shù)等。構(gòu)建了高效表達(dá)載體在大腸桿菌JM109中成功表達(dá)了CSDS001和CSDS008菌株的hrpN，重組harpinEcc蛋白經(jīng)與Ecc71的抗體做Westernblot確認(rèn)。重組的CSDS001和CSDS008的的harpinEcc蛋白均能引起煙草和玻璃海棠典型的HR癥狀，均能促進(jìn)海棠的生長(zhǎng)發(fā)育，但兩種蛋白質(zhì)促進(jìn)海棠生長(zhǎng)發(fā)育的能力存在顯著差異。 3.成功地純化了haxpinEcc蛋白包含體

8、，SDS電泳顯示純度達(dá)到90﹪，大腸桿菌表達(dá)的重組harpinEcc蛋白是不溶的包含體/聚集體狀態(tài)，但其誘導(dǎo)煙草HR的生物學(xué)活性并未受到影響。通過8M尿素加溫溶解蛋白包含體，再通過透析復(fù)性，harpinEcc復(fù)性率達(dá)70﹪以上。harpinEcc蛋白包含體在55℃4h、pH4.04h、pH8.54h、暴露在光照下1周、胰蛋白酶處理2h、室溫下(25℃)存放3個(gè)月、100℃10min等處理下，均能引起煙葉強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)，表明該蛋白質(zhì)具有比

9、較穩(wěn)定的理化性質(zhì)。對(duì)39種植物的過敏反應(yīng)(HR)試驗(yàn)中，有27種表現(xiàn)出HR，這些植物中既有非寄主植物，也有寄主植物。通過對(duì)煙葉葉片局部涂抹harpinEcc蛋白，6天后在異位葉片上摩擦接種煙草花葉病毒(TMV)，之后室溫培養(yǎng)連續(xù)觀察21天，局部涂抹harpinEcc蛋白的煙草均未表現(xiàn)肉眼可見病變，對(duì)照煙草則在接種后第8天就表現(xiàn)出典型的TMV病變，證明harpinEcc蛋白誘導(dǎo)了煙草對(duì)TMV的系統(tǒng)抗性。對(duì)harpinEcc蛋白誘導(dǎo)園藝植物

10、抗性和調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)效應(yīng)試驗(yàn)證明，harpinEcc蛋白具有誘導(dǎo)園藝植物產(chǎn)生抗干旱、高溫、低溫等逆境的能力；對(duì)黃瓜、辣椒、煙葉等幾種園藝作物的田間控制性實(shí)驗(yàn)表明，harpinEcc蛋白具有明顯的誘導(dǎo)多種園藝作物抗病性的能力；能顯著誘導(dǎo)煙草、辣椒、土豆、茄子的抗蚜蟲能力；能夠促進(jìn)矮牽牛、玻璃海棠、一串紅、萬壽菊、仙客來、石竹等花卉的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)上述花卉提前開花，誘導(dǎo)了一串紅、仙客來的抗病性；對(duì)能夠引起HR的煙葉、辣椒和不引起HR的

11、黃瓜、桑葉、白菜型油菜等均具有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的功效。 4，擬南芥作為研究病原-植物互作的經(jīng)典模式植物，廣泛應(yīng)用于信號(hào)識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)等防御反應(yīng)機(jī)制的研究。我們采用Affymetrix擬南芥全基因組寡核苷酸表達(dá)譜芯片測(cè)定harpinEcc蛋白誘導(dǎo)后3、12、24、36、48h的擬南芥基因差異表達(dá)情況。誘導(dǎo)后3h差異表達(dá)的基因數(shù)為910個(gè)，其中上調(diào)517個(gè)，24h差異表達(dá)的基因數(shù)為2399個(gè)，其中上調(diào)1357個(gè)，48h差異表達(dá)的基

12、因數(shù)為1755個(gè)，其中上調(diào)1020個(gè)，這些差異表達(dá)基因主要涉及抗病基因、防衛(wèi)基因、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因等，至少涉及到已知的59條pathways，這些代謝途徑之間存在相互影響，表明harpinEcc蛋白激活了擬南芥體內(nèi)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究還發(fā)現(xiàn)有183個(gè)功能未描述的基因參與了對(duì)harpinEcc蛋白的應(yīng)答。 harpinEcc蛋白誘導(dǎo)后3h，共激活169個(gè)植物激素相關(guān)基因的表達(dá)，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素基因

13、、乙烯、蕓苔素等的合成和對(duì)相關(guān)激素的應(yīng)答基因上調(diào)表達(dá)；而茉莉酸的合成相關(guān)基因持續(xù)下調(diào)表達(dá)，茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要基因COI1從12-48h持續(xù)下調(diào)表達(dá)；多胺的生物合成相關(guān)基因也下調(diào)表達(dá)。因此，harpinEcc可通過誘導(dǎo)生長(zhǎng)素、乙烯、細(xì)胞分裂素、赤霉素基因、乙烯、蕓苔素等植物激素的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和提高植物的抗逆性。同時(shí)harpinEcc蛋白還誘導(dǎo)了10個(gè)擴(kuò)展蛋白(expansin)相關(guān)基因表達(dá)，且全部為上調(diào)表達(dá)。

14、 harpinEcc蛋白誘導(dǎo)了大量抗病性相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，包括harpin誘導(dǎo)相關(guān)基因、病程相關(guān)基因、R基因、熱休克蛋白相關(guān)基因等。在處理后3-48h，harpin誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白家簇及harpin誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)蛋白基因、編碼病程相關(guān)蛋白PR-1、PR-5、幾丁質(zhì)酶、病程相關(guān)甜蛋白等基因持續(xù)上調(diào)表達(dá)，PDF1.2、PDF2.5基因在24h內(nèi)上調(diào)表達(dá)。病程相關(guān)蛋白基因PR-1、PR-5是水楊酸依賴途徑抗性的標(biāo)志性基因，PDF1.2是依

15、賴乙烯/茉莉酸途徑抗性的標(biāo)志性基因，證明harpinEcc蛋白同時(shí)激活了擬南芥的水楊酸依賴和乙烯/茉莉酸依賴抗性途徑；同時(shí)，類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶查耳酮合成酶基因、查耳酮異構(gòu)酶基因持續(xù)上調(diào)表達(dá)，證明harpinEcc蛋白激活了苯丙氨酸解氨酶介導(dǎo)的抗性途徑；此外，harpinEcc蛋白處理后3h，還誘導(dǎo)了8個(gè)R基因的上調(diào)表達(dá)，均為編碼含富亮氨酸重復(fù)序列的蛋白家族基因；在harpinEcc誘導(dǎo)后3-48h都有大量熱休克蛋白的表達(dá)，同時(shí)還激

16、活了類固醇激素介導(dǎo)的抗病性途徑。以上因素共同作用，提高了擬南芥的抗病性。通過對(duì)harpinEcc蛋白誘導(dǎo)擬南芥差異基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，其誘導(dǎo)的抗蟲性可能是乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑與凝集素共同作用的結(jié)果。 發(fā)現(xiàn)了幾類受體相關(guān)基因的表達(dá)，包括受體蛋白激酶、整合素、G蛋白偶聯(lián)受體，這幾類受體均能直接接收胞外信號(hào)，推測(cè)harpinEcc蛋白與植物互作時(shí)可能與幾種不同類型的受體相互作用。對(duì)harpinEcc蛋白誘導(dǎo)抗性的信號(hào)傳導(dǎo)通路分析表明，ha