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文檔簡介
1、溶癌腺病毒載體(Oncolytic adenovectors),又稱條件復(fù)制型腺病毒載體(Conditionally replicating adenoviruses,CRADs),其中條件復(fù)制的含義是指這種腺病毒載體能夠在腫瘤細胞中特異性復(fù)制,通過病毒擴增,裂解、殺傷腫瘤細胞,而在正常細胞中不能擴增或擴增率極低[1]。正是由于CRADs能夠在腫瘤細胞中復(fù)制、傳播的特性,從而較好地克服了復(fù)制缺陷型病毒載體在基因治療中的基因轉(zhuǎn)移效率低,難
2、以殺滅大多數(shù)腫瘤細胞這一缺點,現(xiàn)已廣泛用于腫瘤基因治療研究中。通常CRADs攜帶治療基因后,較不含治療基因的CRADs能夠更有效的殺傷腫瘤細胞。
為解決重組復(fù)制缺陷型腺病毒治療惡性腫瘤存在的靶向性差、目的基因表達持續(xù)時間短等缺點,本研究采用CRADs構(gòu)建的傳統(tǒng)方法:利用穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒在細胞中同源重組來獲得重組病毒,最后通過空斑純化,排除污染、獲得均一的目的病毒。具體策略為:利用分子生物學(xué)手段對野生7型腺病腺病毒(Adeno
3、virus,Ad)毒進行雙重修飾:一方面利用腫瘤特異性的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerasereverse transcriptase,hTERT)啟動子來調(diào)控制溶癌過程所必需的E1A和E1B-55kDa基因的表達;另一方面將干擾溶癌過程且病毒復(fù)制非必需的E1B-19kDa基因進行缺失,使得到的重組病毒既能保持腫瘤增殖特異性,又具有較高的溶癌效率。
首先構(gòu)建病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pITR-IRES-HEAB。具體為將從人基
4、因組DNA擴增的hTERT啟動子,克隆替換前期構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-HEAB(攜帶腺病毒E1A和E1B-55kDa區(qū))的PCMV IE啟動子,具體構(gòu)建程序為:參照Genbank的Ad7基因組全序列(BK005235),PCR擴增E1A的完整ORF片段,克隆至pIRESneo(clontech)的多克隆位點;擴增E1B-55kDa,克隆至pIRESneo的SmaⅠ/XbaⅠ位點,替換Neor片段;最后PCR擴增Ad7左側(cè)1-470片段并克
5、隆至pIRES-HEAB質(zhì)粒的hTERT基因上游,獲得最終的病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pITR-IRES-HEAB。
野生Ad7病毒株經(jīng)分離、培養(yǎng)及鑒定后,大量擴增病毒,提取其基因組DNA,利用NhelⅠ酶切獲得野生Ad7病毒基因組NhelⅠ大片段(795-14220),酶切野生Ad7病毒基因組得到NotⅠ片段(13171-ITR),將其回收后做為Ad7病毒基因組骨架序列。根據(jù)基因序列的互補重疊部分,將上述酶切片段與病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pITR-I
6、RES-HEAB通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染至A549細胞株,實現(xiàn)細胞內(nèi)基因重組,重組出新型溶癌腺病毒 Ad7OL,空斑純化后,提取重組腺病毒的DNA進行PCR、酶切分析,確定為重組正確的腺病毒株后,進一步用CsCl密度梯度離心純化,并用終點稀釋法(end pointdilution assay, EPDA)測定病毒的滴度。
為了初步研究重組溶癌腺病毒Ad7OL的體外抑殺瘤作用,選用3種端粒酶陽性腫瘤細胞系和1種端粒酶陰性細胞系:A549
7、(人肺癌細胞株)、Hela(人宮頸癌細胞株)和293(人胚腎細胞系);LO2(人胎肝細胞系),從而評價載體的選擇性腫瘤殺傷效應(yīng)。將Ad7OL或野生Ad7感染正常細胞及腫瘤細胞,感染后7d,結(jié)晶紫染色法檢測病毒細胞毒性。
總之,本研究在野生7型腺病毒基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建的E1A/E1B雙重修飾的溶癌病毒,基本上能滿足理想腫瘤增殖病毒主要要求,是研制溶癌病毒過程中的一個有益嘗試,也希望本課題所設(shè)計的7型溶癌腺病毒能為利用不同血清型來源
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