菌膜在原發(fā)舍格倫綜合癥發(fā)病中作用的實驗研究.pdf

1、研究目的：明確細菌菌膜與原發(fā)SS的發(fā)病關(guān)系，通過研究菌膜成分藻酸鹽誘發(fā)的免疫反應(yīng)對正常腮腺腺細胞的作用探討原發(fā)SS發(fā)病機理，采用藻酸鹽誘發(fā)人類原發(fā)SS臨床表現(xiàn)的動物模型。 研究方法：首先分離獲取成活率高且保持功能的腮腺腺細胞，采用改良DMEM培養(yǎng)基進行腮腺腺細胞的原代及傳代培養(yǎng)，觀察腮腺腺細胞生長狀況，透射電鏡觀察腮腺腺細胞的超微結(jié)構(gòu)，利用細胞免疫組化法檢測細胞中泛角蛋白、α-淀粉酶蛋白和肌動蛋白的表達情況以鑒定細胞來源，并且分

2、別檢測α-淀粉酶蛋白在不同代次腺細胞中的表達情況判斷其分泌功能。 將藻酸鹽(Alginate)與BSA偶連形成具有較強免疫原性的Alginate-BSA交聯(lián)物免疫兔，按抗原量1.0mg/kg接種于新西蘭白兔皮內(nèi)，間隔10d加強免疫1次，共加強4次后，利用間接ELISA法檢測藻酸鹽抗體效價；將原代培養(yǎng)的兔腮腺腺細胞按104個/ml接種到96孔板上，置入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3d，分為5組：A空白對照組、B牛血清白蛋白組、C藻酸鹽組、D

3、抗藻酸鹽血清組和E抗藻酸鹽血清+藻酸鹽組，分別加入PBS、牛血清白蛋白、藻酸鹽或(和)新鮮抗藻酸鹽血清繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1h、6h、12h和24h不同的時間點，取出96孔培養(yǎng)板，采用MTT法檢測5組腮腺腺細胞增殖情況；5倒置相差光學顯微鏡觀察不同組腮腺腺細胞生長、形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化；掃描電鏡觀察E組腺細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 動物試驗采用已獲藻酸鹽免疫的新西蘭白兔16只，隨機分為A1、B1兩組，A2、B2組各為6只正常新西蘭白兔作為平行對

4、照組，間隔1d經(jīng)腮腺導管灌注藻酸鹽，分別于灌注前、灌注7次(A1、A2組)和14次(B1、B2組)檢測類似于人類SS在唾液量、施墨實驗(Schirmertest)、T淋巴細胞亞群、腮腺造影和組織病理等方面的改變。 研究結(jié)果：體外培養(yǎng)腮腺腺細胞具有一定的增殖能力，可傳3代，存活4w以上；透射電鏡下腺細胞表面可見到微絨毛、胞漿皺褶和細胞頂部的酶原顆粒，胞核大卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)見線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；免疫組化染色顯示培養(yǎng)腮腺腺細胞特異性抗體

5、泛角蛋白及α-淀粉酶蛋白染色強陽性(+++)，胞膜和(或)胞漿內(nèi)可見棕黃色點狀分布的顆粒；肌動蛋白染色陰性(-)；測定培養(yǎng)腮腺腺細胞α-淀粉酶的表達水平，不同代次腺細胞α-淀粉酶的表達水平不同，在4代細胞中的表達水平依次是79.6％，76％，47.7％和2.4％，原代細胞到第3代強度隨傳代次數(shù)的增加而逐漸減弱，原代和第1代細胞的α-淀粉酶的表達強度均較高并且可維持一定水平，兩者無差異(P＞0.05)。第2代細胞的α-淀粉酶水平明顯低于原

6、代和第1代，與2者差異顯著(P＜0.05)，第3代基本測不到α-淀粉酶的表達。所得結(jié)果說明原代和傳代培養(yǎng)第1代腮腺腺細胞保持良好的增殖能力和分泌功能。 Alginate-BSA交聯(lián)物免疫兔約40天后，采用間接ELISA法測得抗藻酸鹽血清的效價可達到1：400。并測定抗藻酸鹽血清和藻酸鹽2者適宜反應(yīng)濃度：藻酸鹽為40ug/ml，抗藻酸鹽血清的稀釋度為1：100。MTT法分別檢測在1h、6h、12h和24h時間檢測A、B、C、D、E

7、組中腮腺腺細胞增殖情況的結(jié)果顯示：在1h、6h、12h檢測A、B、C、D、E組的OD值，組間均無差異(P＞0.05)；在24h點，E組與A、B、C、D組差異顯著(P＜0.05)，說明抗藻酸鹽血清和藻酸鹽免疫反應(yīng)24h出現(xiàn)對腺細胞的增殖有顯著的抑制。倒置相差光學顯微鏡下觀察A、B、C、D組腺細胞的生長和形態(tài)未見異常，E組在12h時間點和24h點可觀察到個別腺細胞表面有破裂，胞漿外溢，細胞形態(tài)不完整；掃描電鏡觀察E組在6h點即有個別腺細胞胞

8、膜有破裂，呈圓孔形，細胞的輪廓仍清晰完整；12h可見破裂細胞數(shù)增多，且細胞膜上破裂孔增多變大。24h可見細胞的形態(tài)不完整，有較大范圍胞膜破裂，細胞崩解，說明這種免疫反應(yīng)直接攻擊正常腮腺腺細胞的胞膜，導致胞膜破裂，腺細胞功能喪失。 分別在灌注前、灌注7次和14次檢測實驗組和對照組的唾液量、施墨實驗和T淋巴細胞亞群的變化：灌注7次和14次唾液量明顯低于灌注前和對照組，差異顯著(P＜0.05)，而且，灌注14次組唾液量明顯少于灌注7次

9、組，差異顯著(P＜0.05)，說明腮腺灌注藻酸鹽后，其唾液量減少。并隨著灌注次數(shù)的增多，腮腺組織的破壞加重，腮腺的分泌功能喪失越多；Schirmertest在A1、B1、A2、B2組中均無差異(P＞0.05)，提示淚腺功能正常；灌注前A1組和B1組的CD4值明顯高于對照組差異顯著(P＜0.05)；CD4/CD8的值在灌注前也明顯大于對照組，差異有顯著性(P＜0.05)，說明機體獲得藻酸鹽免疫后就已經(jīng)表現(xiàn)出免疫功能的改變，主要是CD4細胞

10、增多，CD4/CD8比值增大，獲免疫后細胞免疫功能增強；經(jīng)腮腺導管灌注藻酸鹽7次后，2組的CD8的值增大，與灌注前和對照組均有顯著差異(P＜0.05)；而CD4則無明顯變化，CD4/CD8的比值明顯較灌注前減小，差異也有顯著性(P＜0.05)；而與對照組無差異(P＞0.05)。從這組結(jié)果可以得出，灌注7次藻酸鹽后，主要是CD8的值發(fā)生變化，增大明顯，導致CD4/CD8的比值回落，但是CD4和CD8的值均高于正常，顯示免疫功能紊亂；灌注1

11、4次后，CD4的變化不明顯，CD8仍有上調(diào)，導致CD4/CD8比值變小，與灌注前、灌注7次和對照組均有差異(P＜0.05)。說明機體的免疫功能減低，而CD4和CD8卻仍高于正常對照組，提示機體免疫功能紊亂的程度加重。 腮腺造影的結(jié)果顯示灌注的次數(shù)不同其影像也不同：灌注7次主要表現(xiàn)為主導管周圍呈羽毛狀改變，而腺體未見異常；灌注14次后腮腺造影可見導管增粗、末梢分枝導管有點狀、球狀影像，腺體部有充盈缺損。組織病理HE染色結(jié)果也和灌注

12、次數(shù)有關(guān)，A1組(灌注7次)腮腺組織切片可見，腺體內(nèi)與導管周圍有大量的致敏細胞、炎癥細胞和少量淋巴細胞浸潤，組織表現(xiàn)為變態(tài)反應(yīng)象，可見肥大細胞和單核細胞，腺泡正常結(jié)構(gòu)混亂，腺泡壞死，有大量嗜酸性無定形物質(zhì)，導管上皮增生，肌上皮島形成，沒有見到纖維結(jié)締組織，收集的唾液量也較對照組明顯減少，說明腺體組織受到藻酸鹽免疫反應(yīng)作用后腺體組織破壞，分泌功能降低；B1組(灌注14次)腮腺組織以腺泡萎縮和淋巴細胞浸潤為主要征象，有大量嗜酸性無定形物質(zhì)，

13、大片的腺泡呈空泡樣，正常的腺泡結(jié)構(gòu)消失，腺管增粗，有少量淋巴細胞包繞在腺組織周圍，腺體組織破壞的程度更加嚴重，大部分腺體分泌功能喪失，測得的唾液量也較灌注7次的量有明顯減少，以上影像學結(jié)果、病理學結(jié)果和腺體分泌功能檢測所反映的病理過程基本是吻合一致的，腮腺組織受到的損害隨著灌注次數(shù)的增加而加重。 結(jié)論：藻酸鹽在兔腮腺中的免疫反應(yīng)所造成的損害類似于人類原發(fā)SS腮腺的臨床表現(xiàn)，證實了菌膜的主要成分藻酸鹽可能是原發(fā)SS發(fā)病的原因；藻酸