新結(jié)構(gòu)的新生血管抑制劑的篩選及其對(duì)子宮內(nèi)膜作用的研究.pdf

1、目的：篩選以2-甲氧雌二醇為基礎(chǔ)的新結(jié)構(gòu)的新生血管抑制劑和研究2-甲氧雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)的影響并初步探討其作用機(jī)制。 方法：1．剪開(kāi)臍動(dòng)脈以避免血細(xì)胞污染、膠原酶灌注消化，并給予充足的營(yíng)養(yǎng)，體外分離、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。2．建立兩種新生血管抑制劑篩藥模型：HUVEC增殖抑制試驗(yàn)以及雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)，并篩選藥物。3．采用膠原酶消化，200目的尼龍篩過(guò)濾，傳代2次，體外分離、培養(yǎng)正常人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞；同

2、時(shí)采用醋酸甲地孕酮(MPA)及雙丁酰環(huán)磷酸腺苷(db-cAMP)誘導(dǎo)蛻膜化，形成蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞。4．子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞接種后，分別加入1、10、50μmol/L濃度的2-甲氧雌二醇，空白對(duì)照組不加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，然后用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)方法，分析2-甲氧雌二醇對(duì)VEGF分泌的影響，并用實(shí)時(shí)定量RF-PCR法從mRNA水平對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。5．向蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中分別加入1、10、50μmol/L 濃度的2-

3、甲氧雌二醇，空白對(duì)照組不加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，然后用ELISA方法，分析2-甲氧雌二醇對(duì)VEGF分泌的影響，并用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法從mRNA水平對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。6．免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析2-甲氧雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞雌激素受體(ER)表達(dá)的影響。 結(jié)果：1．體外分離、培養(yǎng)HUVEC，純度達(dá)99％。2．成功建立雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)?zāi)Ｐ停籋UVEC增殖抑制試驗(yàn)確定了2-甲氧雌二醇IC<,50>=0.931

4、2 μmol/L，且結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道(0.84 μmol/L)接近。目前尚未篩出活性與2-甲氧雌二醇類似或優(yōu)于2-甲氧雌二醇的目標(biāo)化合物。3．成功培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞；傳2代后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞純度較高，此時(shí)誘導(dǎo)蛻膜化，可見(jiàn)不僅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，且能合成和分泌催乳素(PRL)。4．低劑量2-甲氧雌二醇能降低子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞上清液中VEGF水平(P<0.05)；中劑量雖然能降低上清液中VEGF水平，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高劑量時(shí)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞上清

5、液中VEGF水平較對(duì)照組升高，亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證分析的結(jié)果和ELISA結(jié)果一致。5．低、中劑量的2-甲氧雌二醇可以降低蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞上清液中VEGF水平(P<0.05)；而高劑量則顯著降低上清液中VEGF水平(P<0.01)。實(shí)時(shí)定量RF-PCR驗(yàn)證分析的結(jié)果和ELISA結(jié)果一致。6．免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果顯示，三個(gè)濃度的2-甲氧雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞ER表達(dá)均無(wú)影響。 結(jié)論

6、：1.2-甲氧雌二醇可以抑制雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械难苌?；HUVEC增殖抑制試驗(yàn)確定了2-甲氧雌二醇IC<,50>=0.9312μmol/L，且結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道(0.84μmol/L)接近，結(jié)合子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞排除細(xì)胞毒性結(jié)果，再次確認(rèn)了2-甲氧雌二醇的抑制新生血管形成活性，同時(shí)也證實(shí)兩種篩藥模型的建立。2.目前已成功合成了兩類保留2-甲氧雌二醇活性必需基團(tuán)的與雌激素骨架相似的非甾體化合物，但在加上米非司酮抗孕激素受體基團(tuán)這一步驟上

7、出現(xiàn)困難，故尚未獲得目標(biāo)化合物。3.2-甲氧雌二醇低中劑量能稍降低子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF水平，高劑量時(shí)則稍促進(jìn)VEGF分泌，但影響程度均不大；提示2-甲氧雌二醇對(duì)靜止細(xì)胞功能影響較小。4.采用MPA和db-cAMP誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，模擬人體正常的蛻膜化過(guò)程。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化后，不僅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，而且能合成和分泌PRL，均證明子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程的發(fā)生。5.2-甲氧雌二醇低中劑量即降低蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞

8、分泌VEGF水平；而高劑量則顯著抑制VEGF的分泌。眾所周知，血管生成是胚泡植入的關(guān)鍵步驟，而VEGF又在血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此上述結(jié)果提示該藥可通過(guò)抑制VEGF而影響胚泡植入及妊娠維持，從而發(fā)揮抗早孕作用。同時(shí)2-甲氧雌二醇不影響蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞ER表達(dá)，因此上述作用不是通過(guò)影響ER表達(dá)而發(fā)揮作用的，提示2-甲氧雌二醇作用后并不影響雌激素的分泌及其相關(guān)效應(yīng)，推測(cè)由此引發(fā)的不良反應(yīng)減少。傳統(tǒng)的抗早孕藥物均依靠影響雌孕激素