高靜水壓刺激對(duì)血小板活化的影響及PPARγ的保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究背景和總體思路
　　 已經(jīng)明確高血壓病患者血小板聚集性和粘附性均明顯亢進(jìn)。由于相關(guān)研究多集中于臨床觀察,但高血壓病患者常合并多種異常情況,除血壓外,其他并存的因素也參與血小板激活。因此血壓本身對(duì)血小板激活的作用及其程度尚不明確。為此,我們?cè)陔x體孵育的條件下,觀察靜水壓對(duì)血小板的影響。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn),血小板不僅能合成蛋白質(zhì),還通過(guò)剪切預(yù)存于多聚核糖體中的未成熟的RNA為成熟的mRNA,翻譯mRNA合成蛋白質(zhì)。當(dāng)血

2、小板激活時(shí)起動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng),導(dǎo)致特異性的RNA被翻譯并產(chǎn)生蛋白質(zhì)。由于血小板源于巨核細(xì)胞,巨核細(xì)胞的mRNA也能直接影響血小板激活后的功能。我們?cè)O(shè)定,高血壓病患者的血小板的異常變化,部分可能是巨核細(xì)胞變化的繼發(fā)變化。目前,高血壓對(duì)外周循環(huán)巨核細(xì)胞是否影響,是否會(huì)進(jìn)而影響血小板的狀態(tài)及功能,尚未見研究報(bào)道。
　　 血小板含有高水平的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PeroxisomeProliferator Activat

3、ed Receptor,PPARγ)。PPAR的作用廣泛,涉及多方面。研究證實(shí)血小板的PPARγ具有活性,能抑制血小板的激活。對(duì)于高血壓病患者血小板PPARγ的變化,尤其是PPARγ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,值得深入研究。
　　 基于上述未決問題,本課題利用自制的高靜水壓裝置,在體外利用不同的壓力條件孵育血小板及巨核細(xì)胞,進(jìn)行以下幾方面的研究:高靜水壓對(duì)血小板的形態(tài)和結(jié)構(gòu)及功能的影響、高靜水壓對(duì)巨核細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)及功能的影響和PPARγ

4、在高靜水壓刺激血小板中信號(hào)傳導(dǎo)作用。通過(guò)上述研究,以加深高血壓對(duì)血小板激活認(rèn)識(shí),為臨床更有效地防治高血壓靶器官損害提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部份高靜水壓對(duì)血小板的形態(tài)和結(jié)構(gòu)及功能的影響
　　 目的:
　　 利用體外靜水壓孵育血小板的模型,觀察不同壓力,以及同一壓力不同時(shí)間對(duì)血小板的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的影響。
　　 方法:
　　 建立高壓培養(yǎng)的模型后,以180mmHg處理血小板不同時(shí)段(0h、

5、1h、6h和18h)和不同靜水壓(0mmHg、120mmHg、180mmHg和240mmHg)處理血小板18小時(shí),觀察以下指標(biāo)。1、在電鏡下觀察血小板超微結(jié)構(gòu)的變化,全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血小板形態(tài)參數(shù),全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血小板孵育液中LDH:2、測(cè)定血小板聚集率和流式細(xì)胞儀測(cè)定血小板活化表面標(biāo)志物PAC-1和CD40L(CD154)；3、免疫印跡法測(cè)定血小板內(nèi)CD40L(CD154)、P-sclectin、PPARy和CaSpase

6、3的蛋白表達(dá)；4、血小板PPARγ活性的測(cè)定。
　　 結(jié)論:
　　 1、隨著壓力增高,血小板形態(tài)發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為平均血小板體積(MPV)顯著減少,分布寬度的增加；在180mmHg靜水壓下,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也出現(xiàn)類似改變。
　　 2、較高的高靜水壓(180mmHg和240mmHg)使活化的GPⅡb/GPⅢa復(fù)合體(PAC-1)增多,促使血小板活化和聚集。
　　 3、高靜水壓(180mmHg和240mmHg

7、)可使血小板內(nèi)P-slectin的表達(dá)量增加,其胞漿的CD40L(CD154)裂解,胞膜上CD40L(CD154)增加,血小板中炎癥相關(guān)分子釋放增加,促進(jìn)炎癥反應(yīng)。
　　 4、靜水壓刺激的血小板中PPARγ蛋白含量無(wú)明顯變化,但其活性隨著壓力和時(shí)間的增加而有一定幅度的增加。
　　 5、180mmHg和240mmHg刺激血小板18小時(shí)導(dǎo)致血小板破壞,機(jī)制與高靜水壓激活血小板Caspase3,導(dǎo)致血小板凋亡有關(guān)。
　　

8、 第二部份高靜水壓對(duì)巨核細(xì)胞的影響
　　 目的:
　　 研究靜水壓對(duì)巨核細(xì)胞系Meg-01形態(tài)、結(jié)構(gòu)及血小板功能相關(guān)基因表達(dá)的影響,探討高靜水壓對(duì)巨核細(xì)胞功能的影響。
　　 方法:
　　 建立巨核細(xì)胞高壓培養(yǎng)的模型,分別用不同的壓力(0、120、180、240mmHg)刺激Meg-01細(xì)胞,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率,TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比,RTPCR測(cè)定GPⅡb、GPⅢa、P-selectin

9、和PPARγ基因表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、120mmHg靜水壓可促進(jìn)Meg-01細(xì)胞增殖,而180mmHg和240mmHg則抑制巨核細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。
　　 2、180mmHg和240mmHg靜水壓刺激促進(jìn)Meg-01細(xì)胞表達(dá)GPⅡb/GPⅢa和P-slectin。
　　 3、120mmHg靜水壓下PPARγ表達(dá)增強(qiáng),在更高靜水壓則無(wú)變化。
　　 第三部份PPARγ對(duì)高靜水壓處理血小板的

10、保護(hù)作用
　　 目的:
　　 探討PPARγ在高靜水壓處理的血小板中保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)分為C、C+wy、C+gw、H、H+wy和H+gw六組(C為正常大氣壓孵育,H為180mmHg靜水壓孵育,wy為PPARγ激動(dòng)劑,gw為PPARγ,阻斷劑),處理18小時(shí)后檢測(cè)各組血小板聚集率,血小板內(nèi)鈣離子濃度,血小板內(nèi)和孵育基中NO的量,血小板內(nèi)血小板內(nèi)的iNOS、eNOS、CD40L(CD154)

11、、NFκB和P-selectin蛋白量的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、在180mmHg刺激18小時(shí)的血小板,PPARγ的激動(dòng)劑Wy14643能顯著降低血小板聚集和活化,降低血小板膜上PAC-1的表達(dá),可能通過(guò)降低血小板內(nèi)鈣離子濃度,升高血小板內(nèi)的eNOS的表達(dá),降低iNOS的表達(dá),而升高血小板內(nèi)和孵育液中的NO的量這兩條途徑。
　　 2、在180mmHg刺激18小時(shí)的血小板,PPAR7的阻斷劑Gw9662并不能