新型重組蛋白TAT-54R-KDEL的構建和表達及其對CXCR4的表型敲除活性研究.pdf

1、研究表明，趨化因子受體CXCR4(CXC chemokine receptor4)與其特異性生理配體,基質細胞衍生因子－1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)相互作用在多種惡性腫瘤轉移過程中起著關鍵作用。因而，CXCR4被認為是有效防治腫瘤轉移的重要靶點。本課題組曾對SDF-1進行遺傳改造，獲得了一種 CXCR4競爭性拮抗劑：SDF-1/54R,并證實：SDF-1/54R可通過誘導CXCR4內(nèi)吞，使

2、細胞膜表面CXCR4迅速消失。但由于內(nèi)吞進細胞的CXCR4又回到細胞膜表面重新利用，導致SDF-1/54R對CXCR4介導細胞遷移的抑制效應也隨之消失[1]。因此，欲獲得真正具有臨床抗腫瘤轉移應用價值的CXCR4拮抗劑，嘗試持久性阻斷CXCR4的技術路線是十分必要的。鑒于胞內(nèi)因子(intrakine)分子量小，特異性強，靶向性高等優(yōu)點，將胞內(nèi)因子表型敲除技術用于持久性阻斷腫瘤細胞CXCR4的表達不失為一種新思路。為此，課題組進一步嘗試將

3、SDF-1/54R與內(nèi)質網(wǎng)定位片段KDEL嵌合，從而構建了胞內(nèi)因子SDF-1/54R/KDEL的真核載體和腺病毒載體。體外實驗證實，轉染SDF-1/54R/KDEL基因的MOLT-4細胞膜表面CXCR4的表達量顯著降低,其轉移受到持久性抑制。然而，考慮到轉基因技術操作復雜，在整體應用上安全性無法保證等局限，我們有必要進一步嘗試直接向胞內(nèi)遞送趨化因子蛋白，在蛋白水平上實現(xiàn)CXCR4表型敲除以抑制腫瘤轉移的可能性。為此，本課題借鑒穿膜肽的最

4、新研究成果，再次對SDF-1/54R/KDEL進行基因改造，將其與高效穿膜載體即轉錄活化因子的TAT(47~57)片段（YGRKKRRQRRR）連接，從而構建了一種新的嵌合蛋白：TAT/54R/KDEL。擬利用TAT(47~57)的高效穿膜能力和KDEL的內(nèi)質網(wǎng)定位作用，將CXCR4的特異性拮抗劑SDF-1/54R導入腫瘤細胞，在蛋白水平上實現(xiàn)對其細胞膜表面CXCR4的敲除，進而實現(xiàn)抑制腫瘤細胞轉移的目的。本研究結果將為證實這一防治腫瘤

5、轉移新策略的可行性和有效性提供直接的實驗依據(jù)，并為其它以CXCR4為靶點的腫瘤分子治療提供有益的參考價值。
　　目的：
　　對SDF-1/54R進行二次基因改造，將其與高效穿膜載體TAT(47~57)和內(nèi)質網(wǎng)定位片段KDEL連接，構建一種新的嵌合蛋白：TAT/54R/KDEL，并在體內(nèi)外檢測其CXCR4表型敲除功能及對腫瘤轉移的抑制作用。
　　方法：
　?、僖员臼覙嫿ǖ闹亟M質粒GFP/pET-28a(+)和54R

6、/pET-28a(+)為模板，采用PCR方法擴增GFP/KDEL和54R/KDEL基因，PCR產(chǎn)物酶切后插入pTAT-HA原核表達載體 TAT編碼區(qū)下游的多克隆位點，即獲得含有目的基因的重組質粒TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL/pTAT-HA。
　?、趯㈣b定正確的重組質粒TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL/pTAT-HA轉化表達菌株BL21，用0.5μM IPTG誘

7、導表達，表達產(chǎn)物采用Western blot法進行鑒定。并利用表達產(chǎn)物N-端所帶的6×His-Tag融合標簽，采用鎳離子親和層析和HPLC純化目的蛋白，由于嵌合蛋白TAT/GFP/KDEL為可溶表達，純化后的蛋白只需簡單的透析、濃縮即可得到有活性的蛋白。而嵌合蛋白TAT/54R/KDEL以包涵體形式表達，純化后的蛋白需要聯(lián)合采用稀釋、透析和超濾的方法進行復性。
　?、垠w外實驗，首先檢測TAT/GFP/KDEL對高表達CXCR4的M

8、OLT-4細胞的穿膜能力和內(nèi)質網(wǎng)定位情況以考察本課題設計方案的可行性，然后分別利用熒光顯微鏡和熒光酶標儀檢測TAT/54R/KDEL對高表達CXCR4的MOLT-4細胞和不表達該受體的CNE2細胞的穿膜能力和靶向性,并利用激光共聚焦顯微鏡檢測TAT/54R/KDEL的內(nèi)質網(wǎng)定位情況。TAT/54R/KDEL的CXCR4表型敲除能力是其體外活性研究的重點，為此，我們首先采用流式細胞儀檢測 TAT/54R/KDEL對MOLT-4細胞膜表面C

9、XCR4表達量的影響；然后利用趨化實驗考察TAT/54R/KDEL對SDF-1誘導的MOLT-4細胞轉移的抑制作用；最后通過Western blot實驗進一步評價TAT/54R/KDEL對細胞表面CXCR4表型敲除的作用效果。此外，還利用臺盼藍排斥實驗和MTT法檢測了TAT/54R/KDEL的細胞毒性及其對細胞增殖的影響。
　?、軐⒏弑磉_ CXCR4的小鼠乳腺癌細胞4T1，原位接種于 BALB/c小鼠第2對乳房脂肪墊以建立小鼠乳腺

10、癌轉移模型，并利用該模型考察 TAT/54R/KDEL對移植部位乳腺癌細胞生長和轉移的抑制效應。進一步采用RT-PCR和流式細胞儀檢測乳腺癌原發(fā)灶及轉移灶的CXCR4和SDF-1表達量的變化，以探討TAT/54R/KDEL對乳腺癌轉移的抑制效應與其CXCR4表型敲除能力之間的相互關系，從而初步闡明 TAT/54R/KDEL在體內(nèi)的作用機制。
　　結果：
　?、僖员臼覙嫿ǖ腉FP/pET-28a(+)和54R/pET-28a(

11、+)為模板，PCR擴增出目的基因GFP/KDEL和54R/KDEL，并采用PCR、酶切和測序方法證實目的基因已正確地插入pTAT-HA載體。
　?、谟肳estern blot法證實含有目的基因的重組質粒 TAT/GFP/KDEL/pTAT-HA和TAT/54R/KDEL/pTAT-HA在BL21菌株中成功實現(xiàn)了高表達，采用鎳離子親和層析和HPLC純化得到了純度大于95％的目的蛋白 TAT/GFP/KDEL和TAT/54R/KDEL

12、。TAT/54R/KDEL經(jīng)稀釋、透析和超濾等處理后實現(xiàn)了復性。
　?、鄯謩e利用熒光顯微鏡、流式細胞儀和熒光酶標儀證實TAT/GFP/KDEL具有高效的穿膜能力，并能準確地定位于內(nèi)質網(wǎng)，從而初步證實了本課題設計方案的可行性。與不表達CXCR4的CNE2細胞相比，TAT/54R/KDEL對高表達該受體的MOLT-4細胞具有更高的穿膜能力和靶向性，并且也能準確地定位于內(nèi)質網(wǎng)，為其進一步實現(xiàn) CXCR4表型敲除奠定了基礎。采用流式細胞術

13、證實 TAT/54R/KDEL對MOLT-4細胞表面 CXCR4具有持續(xù)地表型敲除能力。趨化實驗表明TAT/54R/KDEL能夠有效地抑制SDF-1誘導的腫瘤細胞遷移，Western blot實驗進一步證實與SDF-1/54相比較，TAT/54R/KDEL對腫瘤細胞CXCR4的表型敲除效果更完全。臺盼藍排斥實驗和MTT法證實TAT/54R/KDEL沒有細胞毒性，不影響CNE2細胞的增殖，而對MOLT-4細胞的增殖具有抑制作用。
　

14、?、軐⒏弑磉_CXCR4的乳腺癌細胞4T1原位接種于BALB/c小鼠第2對乳房脂肪墊成功建立了小鼠乳腺癌轉移模型，并利用該模型證實 TAT/54R/KDEL對移植部位乳腺癌細胞的生長和轉移具有抑制效應。進一步采用RT-PCR和流式細胞術證實乳腺癌的轉移與細胞膜表面 CXCR4及轉移組織 SDF-1的高表達密切相關，TAT/54R/KDEL通過蛋白水平上CXCR4的表型敲除在一定程度上抑制了乳腺癌的轉移。
　　結論：
　?、俪晒?/p>

15、構建了TAT/54R/KDEL的大腸桿菌表達系統(tǒng)，并且表達、分離純化出具有生物活性的TAT/54R/KDEL蛋白。
　　② TAT/54R/KDEL具有高效的穿膜能力，并能準確地定位于內(nèi)質網(wǎng)，初步證實了本課題設計方案的可行性。
　?、垠w外實驗證實TAT/54R/KDEL對MOLT-4細胞膜表面的CXCR4具有持續(xù)地表型敲除能力，并且能夠有效抑制SDF-1誘導的細胞遷移。
　?、芡ㄟ^小鼠乳房脂肪墊移植4T1細胞，成功建立