海洋來源化合物YCUA-6、YC-72、GC-29抗H5N1高致病流感病毒機理的研究.pdf

1、高致病性流感是一種急性傳染病，引起該疾病的為H5N1高致病性流感病毒。該病毒的天然宿主源于野生禽類，不表現(xiàn)出明顯癥狀，但卻可以導致大量家禽死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失。自1997年中國香港首次證實了H5N1高致病流感病毒感染人類的病例，該病毒具備了跨越種屬障礙感染人類的能力，幸運的是，尚不能造成人與人之間的傳播。目前的數(shù)據(jù)顯示，該病毒的傳播范圍在不斷擴大，感染人數(shù)在不斷上升，未來大范圍的爆發(fā)高致病性流感的可能性越來越大。
　　 高致

2、病流感病毒目前尚無特效治療方法。疫苗被認為是最有效的途徑，臨床上針對H5N1高致病人流感的疫苗正在研制過程中，但實際上疫苗的應用具有滯后性和易變性等缺點，故尚未有理想的人用的高致病流感疫苗問世。藥物治療使用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑和M2離子通道阻斷劑存在一定的副作用，并且臨床上已經(jīng)出現(xiàn)耐藥病毒株。因此，采用新的實驗技術尋找新穎的作用靶點成為研發(fā)抗病毒新藥的重點。
　　 流感病毒侵入細胞作為病毒感染宿主的第一步，同時也是研究抗流感病毒藥

3、物的重要環(huán)節(jié)。血凝素蛋白（HA）在流感病毒侵入宿主細胞過程中起關鍵作用：成熟的HA由HA1和HA2兩個亞基組成，其功能分別為識別并結合宿主細胞表面受體唾液酸（SA）及介導膜融合過程。作為一個新靶點，目前尚未有以HA為靶點的藥物，所以建立以HA為靶點的藥理篩選模型對尋找抗}t5N1高致病流感病毒藥物具有重要意義。
　　 目的：
　　 建立由流感病毒外殼蛋白（HA）與人類免疫缺陷病毒HIV-1核心包裝成的重組病毒藥理篩選模型

4、，尋找作用于HA的抗H5N1高致病流感病毒的化合物并對其進行機制研究。
　　 方法：
　　 （1）應用Western blot和HA抗體結合實驗對HA蛋白的表達情況進行考查；
　　 （2）應用流感病毒外殼蛋白質(zhì)粒HA與艾滋病毒核心基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，制備重組病毒HA（Viet）/HIV-luc，HA（QH）/HIV-luc，HA（H5N2）/HIV-Iuc；
　　 （3）應用重組病毒對不同細胞系感染實驗對重

5、組病毒的感染能力進行考察；
　　 （4）對不同病毒株進行稀釋（1：2，1：4，1：8，1：16，1：32），繪制滴度-相關熒光素酶活性單位曲線，考察該模型進行定量分析的可行性；
　　 （5）應用HA（Viet）/HIV-luc模型對2000余種化合物進行初篩，進一步地采用重組病毒HA（Viet）/MLV-GFP、VSVG/HIV-luc、VSVG/MLV-GFP和不同的細胞系對活性化合物的作用靶點進行確定；
　　

6、 （6）應用MTT法檢測活性化合物對宿主細胞的毒性；
　　 （7）將化合物與宿主細胞孵育不同時間，通過比較考察化合物對宿主細胞表面受體表達的影響；
　　 （8）應用HA介導的細胞細胞融合實驗，進一步考察藥物的作用環(huán)節(jié)。
　　 結果：
　　 （1）對重組病毒模型HA（Viet）的表達采用了分子生物學的方法進行考察：Western blot結果表明，轉(zhuǎn)染48小時后提取宿主細胞蛋白，檢測到HA蛋白的表達，并且清

7、楚看到HA0和HA1條帶；
　　 （2）通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法制備出外殼蛋白為血凝素HA（不同來源），核心為HIV（報告基因為-luc）的重組病毒，即HA（Viet）/HIV-luc、HA（QH）/HIV-kuc、HA（H5N2）/HIV-luc。病毒原液加入后感染293ET細胞，HA（Viet）/HIV-luc相關熒光素酶活性單位（RLUs）達到2×107，接近FB15熒光檢測器的最大檢測值；HA（QH）/HIV-luc和HA（H5

8、N2）/HIV-luc原液感染293ET細胞，其RLUs分別達到106和105，比陰性對照組相的信號高3-5個數(shù)量級，表明模型已經(jīng)初步建立；
　　 （3）隨后進行了重組病毒顆粒對人類不同組織來源的細胞系進行感染性檢測，結果表明重組病毒顆?？梢愿腥径喾N細胞，尤其對293ET和A549細胞的感染性較強。抗體結合實驗結合結果顯示抗HA的多克隆抗體可以阻斷病毒對宿主細胞293ET和A549的感染。以上的實驗證實重組病毒HA（Viet）/

9、HIV-luc具有高度感染能力。病毒滴度-相關熒光素酶活性單位曲線可以清楚的反映出重組病毒核心復制水平與熒光素酶報告基因表達水平間的劑量依賴效應。因此，該模型可用于針對HA侵入宿主細胞和HIV-1復制環(huán)節(jié)的雙靶點藥物篩選模型：
　　 （4）篩選2000余種樣品得到3個海洋來源的活性化合物YCUA-6，YC-72，GC-29，經(jīng)過HA（Viet）/HIV、HA（Viet）/MLV-GFP、VSVG/HIV-luc、VSVG/MLV

10、-GFP四組模型進行特異性比較，結果表明三個化合物在10μM濃度下對HA（Viet）/HIV-luc和HA（Viet）/MLV-GFP的抑制率>50％，而在相同濃度下對VSVG/HIV-luc對照組模型的抑制率<20％，對VSVG/MLV-GFP對照組無抑制作用。因此，YCUA-6，YC-72，GC-29三個海洋來源的化合物具有抗H5N1高致病流感的藥理活性?；钚曰衔镌?0μM濃度下可以阻斷HA（Viet）/HIV-luc感染宿主29

11、3ET和A549細胞，抑制率均大于50％且無顯著性差異；
　　 （5）MTT結果顯示，10μM濃度下，活性化合物對293ET和A549細胞作用48小時、72小時、96小時之后均無細胞毒作用；
　　 （6）活性化合物誘導宿主細胞15分鐘和24小時后，進行感染性檢測，結果發(fā)現(xiàn)感染的程度無顯著性差異；
　　 （7）活性化合物對三株重組病毒HA（Viet）/HIV-luc，HA（QH）/HIV-luc，HA（H5N2）/

12、HIV-luc均有抑制作用，而且IC50值均在1-10μM：
　　 （8）HA介導的細胞.細胞融合實驗結果表明，與DMSO對照組比較，活性化合物都能夠抑制HA蛋白與宿主之間的相互作用，其中以YCUA-6的作用最為明顯。
　　 結論：
　　 （1）成功建立了3種流感病毒血凝素蛋白HA介導的重組病毒模型，成功優(yōu)化了以流感病毒侵入環(huán)節(jié)為靶點的細胞水平的藥理學篩選模型；
　　 （2）通過篩選不同來源的2000余個