抗TNF-α和IL-1βIgY抗體治療豚鼠過敏性鼻炎的實驗研究.pdf

1、目的:
　　探討抗TNF-α及IL-1βIgY滴鼻治療過敏性鼻炎及改善肺組織炎癥的作用及其機制。
　　方法:
　　1、IgY抗體制備
　　2、應用卵清蛋白腹腔注射致敏、滴鼻攻擊方法建立豚鼠過敏性鼻炎模型。
　　3、采用卵清蛋白皮內注射方法鑒定豚鼠過敏性鼻炎模型。
　　4、豚鼠隨機分為正常對照組(C組),過敏性鼻炎模型組(M組),非特異性IgY治療組(Z1組),0.1％抗TNF-αIgY治療組(Z2組)

2、,0.1%抗IL-1βIgY治療組(Z3組),0.1%抗TNF-α和IL-1βIgY治療組(Z4組),丙酸氟替卡松治療組(Z5組)。每組治療結束后在2 h、4 h、8 h等三個時間點觀察結果。
　　5、C組(生理鹽水滴鼻攻擊)、M組、Z1組、Z2組、Z3組、Z4組、Z5組每次OVA滴鼻攻擊和治療時滴入IgY或生理鹽水后再滴入OVA滴鼻攻擊后30min內通過肉眼觀察對豚鼠的癥狀(打噴嚏、抓鼻、流涕量)表現(xiàn),并進行記錄和評分。

3、　　6、各組實驗結束日末次治療和OVA激發(fā)后在2 h、4 h、8 h腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠,使用PBS緩沖液滴注豚鼠鼻腔進行鼻灌洗,并抽取鼻灌洗液(NLF),離心,取上清和沉淀細胞。
　　7、各組實驗結束日末次治療和OVA激發(fā)后在2 h、4 h、8 h腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠,采用心臟穿刺法抽取血液,抗凝,血涂片,離心取血漿。
　　8、各組實驗結束日末次治療和OVA激發(fā)后在2 h、4 h、8 h處死豚鼠,對右肺

4、采用PBS緩沖液進行支氣管肺泡灌洗,抽取支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心取沉淀細胞。
　　9、各組實驗結束日末次治療和OVA激發(fā)后在2 h、4 h、8 h處死豚鼠,分離鼻黏膜組織及左肺、4%多聚甲醛固定組織、石蠟包埋固定的組織、組織切片等,進行病理檢查。
　　10、采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定各組血漿、鼻灌洗液(NLF)中TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、

5、TGF-β等炎癥細胞因子和Th2細胞因子,以及OVA特異性IgE含量。
　　11、采用Wright's染色法對血液、鼻灌洗液(NLF)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞涂片進行染色,計數(shù)嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數(shù)量。
　　12、采用HE染色法對鼻黏膜組織和肺組織切片進行染色,觀察組織病理學變化以及組織嗜酸性粒細胞浸潤,并計數(shù)組織嗜酸性粒細胞數(shù)量。
　　13、采用免疫組織化學染色法對鼻黏膜組織和肺組織

6、切片進行TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-33染色,觀察組織細胞TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-33的表達量的變化。
　　14、采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　結果:
　　1、經(jīng)卵清蛋白腹腔注射致敏、滴鼻攻擊建立Hartley豚鼠過敏性鼻炎模型的成功率為96.63%(172只/178只),豚鼠死亡率69.85%(183只/262只)。
　　2、與M組比較,Z2組、Z3組、Z

7、4組、Z5豚鼠OVA激發(fā)30min內其過敏癥狀明顯減輕,抓鼻次數(shù)、打噴嚏數(shù)、以及流涕量逐漸減少(P<0.05);而C組豚鼠滴鼻生理鹽水時偶見輕度抓鼻,未見打噴嚏和流鼻涕癥狀。
　　3、鼻粘膜:正常對照組(C組)鼻粘膜固有層偶見淋巴細胞浸潤;0.1%抗TNF-α和IL-1βIgY治療組(Z4組)和丙酸氟替卡松治療組(Z5組)在嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤,粘膜層水腫,粘膜上皮細胞完整性等方面明顯輕于模型組(M組)和非特異性IgY治療組

8、(Z1組),同時也輕于0.1%抗TNF-αIgY治療組(Z2組)和0.1%抗IL-1βIgY治療組(Z3組),尤其是在8 h。
　　肺組織:正常對照組(C組)粘膜下層偶見淋巴細胞浸潤;0.1%抗TNF-α和IL-1βIgY治療組(Z4組)和丙酸氟替卡松治療組(Z5組)在嗜酸性粒細胞和中性粒細胞、淋巴細胞浸潤,支氣管粘膜細胞脫落,肺間質水腫,肺泡管結構受損,肺間隔增厚和斷裂,管壁平滑肌增厚等方面明顯輕于模型組(M組)和非特異性IgY

9、治療組(Z1組),同時也輕于0.1%抗TNF-αIgY治療組(Z2組)和0.1%抗IL-1βIgY治療組(Z3組),尤其是在8 h。
　　4、在2h、4h、8h時間點豚鼠鼻粘膜和肺組織中,嗜酸性粒細胞百分率在C組　　5、在鼻粘膜IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表達主要位于鼻粘膜上皮細胞和固有層的腺體細胞內,而在

10、肺組織IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表達主要位于肺泡和肺泡隔腺體細胞和支氣管粘膜上皮細胞的細胞內,其中IL-1β、IL-33在Z4組和Z5組表達量較M組、Z1組、Z2組和Z3組明顯降低,而M組與Z1組、以及Z4組與Z5組的表達量無明顯差異。
　　6、在外周血中2h的Z2、Z3、Z5組,8h的Z4組,嗜酸性粒細胞顯著低于M組(P<0.05)。
　　在鼻灌洗液中2h、4h、8h的Z2、Z3、Z4、Z5組嗜酸性粒細

11、胞顯著低于M組和Z1組(P<0.05);在2h的Z5組,在4h的Z3、Z4、Z5組,在8h的Z3、Z5組,嗜中性粒細胞顯著低于M組(P<0.05);在2h的Z4和Z5組,4h的Z4
　　組,8h的Z3和Z5組,淋巴細胞顯著低于M組(P<0.05)。
　　在支氣管肺灌洗液中2h的Z2、Z3、Z4、Z5組,4h和8h的Z3、Z4、Z5組嗜酸性粒細胞顯著低于M組(P<0.05);在2h的Z2、Z3、Z4組,Z5組,8h的Z4組,嗜

12、中性粒細胞顯著低于M組(P<0.05);在2h的Z1、Z3、Z4、Z5組,4h的Z3和Z5組,8h的Z5組,淋巴細胞顯著低于M組(P<0.05)。
　　7、在鼻灌洗液中2h時,Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-9、IL-33等炎癥細胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組);IL-13的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組、Z1和Z2組;IL-18、TG

13、F-β和IL-22的含量在Z2、Z3、Z4、Z5組顯著低于M組(P<0.05)。4h時,Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、IL-5、IL-9、IL-33等炎癥細胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組);IL-13的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組和Z2組;TNF-α的含量在Z2、Z3、Z4、Z5組顯著低于M組;TGF-β的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組;IL-22的含量在Z4

14、組和Z5組顯著低于M組(P<0.05)。8h時,Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、IL-5、IL-9、TNF-α、IL-33的含量,Z3、Z4、Z5組IL-13和IL-22的含量,Z2、Z4、Z5組TGF-β的含量,Z4組OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組(M組)(P<0.05);Z2、Z3、Z4、Z5組IgE、IL-1β、IL-9、IL-22、TGF-β的含量,Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-33、TNF-α的含量, Z5

15、組IL-13的含量顯著低于非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05)。
　　8、在血漿中2h時,Z2、Z3、Z4、Z5組TNF-α、IL-13、TGF-β、IL-33等炎癥細胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05);Z2、Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-9的含量,Z1組IL-9、IL-13、TNF-α的含量,Z3、Z4、Z5組IL-18的含量,以及Z4和Z5組

16、IL-1β的含量顯著低于模型組(M組)(P<0.05);Z3、Z4、Z5組IL-5,Z4組IL-9,Z3和Z4組IL-18,以及Z4和Z5組IL-1β、IL-22等炎癥細胞因子的含量顯著低于非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05)。4h時,Z2、Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-18、TGF-β、IL-22、IL-33等炎癥細胞因子的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05);Z1、Z2、Z3、Z4

17、、Z5組的IL-13,Z2、Z3、Z4、Z5組的OVA特異性IgE,Z3、Z4、Z5組的IL-1β、IL-9,Z4組的TNF-α等炎癥細胞因子含量顯著低于模型組(M組)(P<0.05);Z2、Z4、Z5組的OVA特異性IgE,Z3、Z4、Z5組的IL-9,Z3和Z5組的IL-13,Z4和Z5組的IL-1β,Z4組的TNF-α等炎癥細胞因子含量顯著低于非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05)。8h時, Z2、Z3、Z4、Z5組IL-

18、5、TGF-β、IL-33等炎癥細胞因子的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05);Z5組的OVA特異性IgE抗體,Z4和Z5組的IL-1β、IL-9,Z1、Z2、Z3、Z4組的IL-13,Z4組的IL-18,Z2和Z5組的TNF-α,以及Z1、Z2、Z3、Z4、Z5組的IL-22等炎癥細胞因子含量顯著低于模型組(M組)(P<0.05);Z5組的OVA特異性IgE抗體,Z4和Z5組的IL-9, Z2、Z

19、3、Z4、Z5組的TNF-α、IL-18,以及Z2組的IL-22等炎癥細胞因子含量顯著低于非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05)。
　　9、在血漿中炎癥細胞因子TNF-α與IL-1β(r=0.623,P<0.01)、IL-5(r=0.676,P<0.01)、IgE(r=0.703,P<0.01)、IL-9(r=0.634,P<0.01)、IL-13(r=0.541,P<0.01)、IL-18(r=0.703,P<0.01)

20、、TGF-β(r=0.779, P<0.01)、IL-22(r=0.324,P<0.01)、IL-33(r=0.723,P<0.01),以及IL-1β與IL-5(r=0.677,P<0.01)、IgE(r=0.723,P<0.01)、IL-9(r=0.745, P<0.01)、IL-13(r=0.576,P<0.01)、IL-18(r=0.558,P<0.01)、TGF-β(r=0.728,P<0.01)、IL-22(r=0.515,P

21、<0.01)、IL-33(r=0.750, P<0.01)等炎癥細胞因子的含量呈正相關。
　　在鼻灌洗液中炎癥細胞因子TNF-α與IL-1β(r=0.761,P<0.01)、IL-5(r=0.619,P<0.01)、IgE(r=0.657,P<0.01)、IL-9(r=0.736,P<0.01)、IL-13(r=0.549,P<0.01)、TGF-β(r=0.625,P<0.01)、IL-22(r=0.704, P<0.01)、I

22、L-33(r=0.691,P<0.01),以及IL-1β與TNF-α(r=0.761, P<0.01)、IL-5(r=0.754,P<0.01)、IgE(r=0.821,P<0.01)、IL-9(r=0.877,P<0.01)、IL-13(r=0.583,P<0.01)、IL-18(r=0.402,P<0.01)、TGF-β(r=0.721,P<0.01)、IL-22(r=0.719,P<0.01)、IL-33(r=0.779, P<0

23、.01)等炎癥細胞因子的含量呈正相關。
　　結論:
　　1、采用卵清蛋白(OVA)和氫氧化鋁凝膠腹腔注射基礎免疫,及OVA滴鼻加強免疫(攻擊或激發(fā))豚鼠成功地建立了穩(wěn)定的過敏性鼻炎豚鼠模型。
　　2、抗TNF-α和IL-1βIgY抗體滴鼻局部治療過敏性鼻炎模型豚鼠能夠有效地抑制由OVA誘導的過敏性鼻炎豚鼠鼻粘膜和肺組織過敏性炎癥病理反應的發(fā)展,并減輕過敏性炎癥病理反應程度。
　　3、抗TNF-α和IL-1βIgY

24、抗體治療豚鼠過敏性鼻炎的作用機制可能是通過抑制嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞等炎癥細胞的增加和浸潤,減少IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33等原炎癥因子和Th2細胞因子,以及OVA特異性IgE抗體的水平而發(fā)揮作用。
　　4、卵清蛋白(OVA)誘導的過敏性鼻炎模型豚鼠并發(fā)過敏性哮喘的癥狀和過敏性炎癥病理改變,充分證明上下呼吸道過敏性炎癥的同步性、一致性,同時也證明治療的一