副粘病毒Tianjin株NP基因的表達及在兒童下呼吸道感染檢測中的應(yīng)用.pdf

1、1999年從呼吸道感染導(dǎo)致死亡的靈長類動物普通棉耳狨猴肺組織中分離到一株病毒，該毒株與普通棉耳狨猴下呼吸道感染之間符合科赫原則。分離株經(jīng)電鏡觀察，具有典型的副粘病毒特征：交叉血凝抑制試驗、RT-PCR擴增HN基因并測序、生物信息學(xué)方法進行核酸序列的聯(lián)配檢索和系統(tǒng)進化分析，表明該毒株與仙臺病毒(SeV)的同源性較高，但推導(dǎo)出的氨基酸序列仍存在較大的差異，暫時命名為副粘病毒Tianjn株。進一步的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，動物中心工作人員都含有此

2、病毒的抗體；正常人群(獻血員)中對此病毒的抗體陽性率高達46.7％；患急性呼吸道感染的兒童抗體陽性率為30～37％，說明此病毒與人類關(guān)系密切。更重要的是，SeV是嚙齒類動物致死性病原體，而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期間，飼養(yǎng)在同一實驗中心的各種實驗用鼠無一例發(fā)病。因而可能是SeV發(fā)生了某些變異而跨越了種屬界限，形成對嚙齒類動物致病性低，對靈長類動物乃至人類致病性高的毒株。目前，我們已經(jīng)完成了對該株病毒的全基因組測序，全基因組序列的系統(tǒng)

3、進化分析，也說明與SeV同源性較高，證明了該株病毒為SeV的一個新基因型。 為了進一步在分子水平上了解其蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，探討致病機制，建立簡便、快速、特異的檢測方法，本研究根據(jù)全基因組序列，設(shè)計合成了三對引物，分三段擴增了副粘病毒Tianjin株的核衣殼蛋白(NP)基因，將擴增片段與質(zhì)粒pET28a連接，分別構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET28a-NP1、pET28a-NP2和pET28a-NP3。經(jīng)誘導(dǎo)表達和純化，獲得了重組蛋白

4、NP1、NP2和NP3。以超速離心純化的病毒和純化的重組蛋白分別免疫兔子和小鼠，制備了多克隆抗體(PcAb)；ELISA、dotblot和westernblot方法檢測了重組蛋白NP1、NP2和NP3的免疫反應(yīng)性；分別以重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原，間接ELISA法檢測了186例下呼吸道感染患兒血清中的IgG、IgM，并與全病毒抗原ELISA法進行了比較。制備了重組蛋白的單克隆抗體(McAb)，對McAb的抗原識別位點、穩(wěn)定性、

5、特異性作了初步分析。 結(jié)果表明：(1)重組蛋白NP1、NP2和NP3能與副粘病毒Tianjin株兔多克隆抗血清特異反應(yīng)，具有天然抗原性，而且抗原性強弱明顯不同，NP3最強，其余依次為NP1和NP2。(2)重組蛋白NP1、NP2和NP3的PcAb與常見呼吸道病原體，如甲、乙型流感病毒，肺炎支原體，甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株(FM1株)無明顯反應(yīng)性；NP1和NP3抗血清與副流感病毒I、III型，NDV呈陽性反應(yīng)，NP2抗血清僅與副流感病

6、毒III型呈陽性反應(yīng)；而副粘病毒Tianjin株鼠多克隆抗血清與除肺炎支原體以外的上述病原體均有交叉反應(yīng)。由于重組蛋白比全病毒抗原易獲得、更安全、有利于提高特異性和敏感性，以重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原檢測抗體，比全病毒抗原更有優(yōu)勢。(3)全病毒抗原ELISA法檢測186例患兒血清標(biāo)本IgG、IgM的陽性率分別是30.65％和19.89％；重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原，IgG陽性率分別為24.19％、22.04％、20.

7、97％；IgM陽性率分別為18.82％、16.67％、15.60％。重組蛋白ELISA法比全病毒抗原ELISA法有特異性更好的趨勢。(4)獲得了一株穩(wěn)定分泌NP2McAb的細胞株G1B9D5。該細胞株培養(yǎng)上清液與NP1和NP3不結(jié)合，說明這株McAb的抗原識別位點在NP蛋白aa202-aa324范圍內(nèi)。McAbG189D5與常見下呼吸道感染病原體沒有交叉反應(yīng)，特異性好。為進一步研究病毒蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及致病機制，建立快速、敏感、特異