BMP信號(hào)對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育及功能的影響.pdf

1、第一章BMP信號(hào)通路主要分子在胚胎后期及出生后大鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)
　　目的: 觀察BMP信號(hào)通路上的主要分子在胚胎后期及出生后大鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　方法: 取不同發(fā)育時(shí)期Fisher344大鼠的脊髓，包括胚胎18天(E18)、出生0、7、14、21、28、56天。用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)蛋白BMP，受體BMPR和下游分子pSmad1/5/8在不同時(shí)期脊髓少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocytes，O

2、Ls)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes，AST)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果: 1.胚胎E18天:此時(shí)間點(diǎn)脊髓內(nèi)尚未探測(cè)到APC標(biāo)記的成熟OLs，GFAP標(biāo)記的AST也不多見(jiàn)。受體BMPR IA主要出現(xiàn)在中央管周圍和白質(zhì)邊緣軟膜下3CB2陽(yáng)性的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞上。配體BMP2和下游分子pSmad1/5/8主要出現(xiàn)在灰質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)，中央管周圍部分細(xì)胞上也有表達(dá)。2.出生0-7天:脊髓內(nèi)OLs和AST的數(shù)量明顯增多。受體BMPR IA主要表

3、達(dá)在3CB2陽(yáng)性和3CB2/GFAP雙陽(yáng)性細(xì)胞上，信號(hào)強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而降低;同時(shí)在脊髓其它部位的細(xì)胞上逐漸出現(xiàn)表達(dá)，但強(qiáng)度較弱。此時(shí)期BMP2和pSmad1/5/8在脊髓內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度明顯提高，主要位于OLs和神經(jīng)元內(nèi)，部分AST也有表達(dá)。3.出生7-21天:BMPR IA、BMP2和pSmad1/5/8均在OLs上高表達(dá)，其中BMPRIA在P14-P21天時(shí)甚至轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)狀態(tài)。各分子在AST上表達(dá)復(fù)雜:其中BMP2表

4、達(dá)于白質(zhì)大部分AST內(nèi)，且強(qiáng)度較高;BMPR IA則僅在少量細(xì)胞上微弱表達(dá);pSmad1/5/8除在軟膜下區(qū)的AST內(nèi)表達(dá)較強(qiáng)外，其它部位的表達(dá)均較弱。4.P28-成年:各分子在AST和OLs的表達(dá)明顯下調(diào)，成年后保持在較低的水平。
　　結(jié)論: 1.出生到成年是大鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞成熟和功能完善的主要時(shí)期，BMP信號(hào)通路的重要成員此時(shí)在OLs和AST上均呈現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明該信號(hào)通路在大鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用;2.B

5、MP信號(hào)各分子在成年大鼠脊髓OLs和部分AST上依然有一定程度表達(dá)，提示其可能參與成年脊髓內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的維持。
　　第二章BMP信號(hào)干預(yù)對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響
　　目的: 通過(guò)體外和體內(nèi)多種方式對(duì)BMP信號(hào)進(jìn)行干預(yù)后，觀察膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育受到的影響。
　　方法: 體外部分:取出生3-5天大鼠脊髓，分離培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)。分別通過(guò)細(xì)胞外增加BMP蛋白濃度和感染攜帶抑制型Smad蛋白的腺病毒在細(xì)胞內(nèi)阻斷通路的

6、方式干預(yù)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，用免疫細(xì)胞化學(xué)和western-blot方法檢測(cè)信號(hào)干預(yù)對(duì)細(xì)胞分化、成熟和髓鞘形成的影響。
　　體內(nèi)部分:在少突膠質(zhì)系細(xì)胞上敲除BMPR1A，免疫組織化學(xué)和原位雜交觀察在體干擾BMP信號(hào)對(duì)脊髓OLs系分化和成熟的影響。
　　結(jié)果: 體外部分:加入BMP4蛋白增加細(xì)胞外配體濃度，當(dāng)BMP4濃度為0.1ng/ml時(shí)，OPCs分化為O1陽(yáng)性O(shè)Ls的百分比與常規(guī)分化組對(duì)比無(wú)顯著差異;隨著加入BMP4蛋白濃度的

7、升高，OPCs分化為O1陽(yáng)性O(shè)Ls的百分比逐漸下降，而形成AST的比例隨之升高。感染攜帶Smad6或Smad7的病毒從細(xì)胞內(nèi)阻斷BMP通路，常規(guī)分化培養(yǎng)后OPCs分化為O1陽(yáng)性O(shè)Ls的百分比與正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組對(duì)比無(wú)明顯差異;但細(xì)胞MBP蛋白的含量降低;把感染病毒的OPCs與脊髓背根節(jié)(DRG)神經(jīng)元共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Smad6或Smad7組包裹軸突形成髓鞘樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組。
　　體內(nèi)部分:選擇性敲除B

8、MPR1A后，動(dòng)物脊髓內(nèi)olig2標(biāo)記或PDGFRαmRNA標(biāo)記的OPCs數(shù)量和分布情況均未發(fā)生明顯改變;而MBP或MBP mRNA染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)或陽(yáng)性面積在出生0天明顯低于未敲除組的動(dòng)物;7天時(shí)，這種差異依然存在，但已不如0天明顯。
　　結(jié)論: 1.增加細(xì)胞外BMP配體濃度主要促進(jìn)前體細(xì)胞向AST分化，抑制OLs的形成。2.從細(xì)胞內(nèi)干擾或阻斷BMP信號(hào)正常轉(zhuǎn)導(dǎo)阻礙OLs成熟，同時(shí)還影響其形成髓鞘的能力。
　　第三章BMP

9、誘導(dǎo)的不同亞型AST對(duì)神經(jīng)元存活及突起生長(zhǎng)的影響
　　目的: 通過(guò)觀察BMP誘導(dǎo)的不同亞型AST對(duì)神經(jīng)元存活及突起生長(zhǎng)的影響，分析AST在脊髓損傷中發(fā)揮雙重作用的可能原因及機(jī)制。
　　方法: 體外分離培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓來(lái)源的膠質(zhì)限制性前體細(xì)胞（GRPs）和成年大鼠脊髓來(lái)源的OPCs，用BMP4誘導(dǎo)分別分化形成Ⅰ型和Ⅱ型AST。Western blot方法檢測(cè)各細(xì)胞表達(dá)纖維粘連蛋白(FN)的情況。把兩種AST分別與DRG神經(jīng)元共

10、培養(yǎng)18hr后，免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色，計(jì)數(shù)DRG神經(jīng)元的存活個(gè)數(shù)，測(cè)量其突起長(zhǎng)度，并進(jìn)行比較分析。
　　結(jié)果: 免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型AST內(nèi)FN表達(dá)強(qiáng)度明顯高于其前體細(xì)胞GRPs（微弱表達(dá)），而Ⅱ型AST及其前體細(xì)胞OPCs內(nèi)均未探及FN信號(hào);Western blot檢測(cè)也出現(xiàn)類似結(jié)果:Ⅰ型AST內(nèi)FN蛋白含量很高，GRPs雖有蛋白條帶，但非常微弱，而Ⅱ型AST及OPCs內(nèi)不能看到明顯的FN蛋白條帶。把各種細(xì)胞分別與DRG神經(jīng)元