小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)育過程中經(jīng)典MHCI類分子表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、近年研究發(fā)現(xiàn)多種在免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并起重要作用的蛋白質(zhì)，在發(fā)育及正常的成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)也有表達(dá)，并且具有重要的非免疫學(xué)功能。其中，經(jīng)典MHCⅠ類分子在CNS的表達(dá)及功能研究已經(jīng)成為大腦發(fā)育及神經(jīng)免疫領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究者已經(jīng)證實(shí)CNS中經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)具有時空特異性，并且其表達(dá)水平與神經(jīng)元電活動顯著相關(guān)。但是，發(fā)育過程中經(jīng)典MHCⅠ類分子時空特異性表達(dá)如何受到調(diào)控，以及神經(jīng)電活動如何

2、影響經(jīng)典MHCⅠ類分子的表達(dá)未見報道。迄今為止，CNS中經(jīng)典MHCⅠ類分子的表達(dá)調(diào)控機(jī)制并不清楚。一系列的研究成果已經(jīng)間接支持經(jīng)典MHCⅠ類分子的表達(dá)與孤獨(dú)癥、癲癇等精神性疾病具有相關(guān)性，解析MHCⅠ類分子在CNS中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制將為進(jìn)一步了解經(jīng)典MHCⅠ類分子參與神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性及突觸修復(fù)等過程的分子機(jī)制，以及進(jìn)一步研究其是否與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)提供必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)在組織水平檢測了經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)的時空特異性

3、，在細(xì)胞水平檢測了神經(jīng)電活動對經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)的影響，并利用原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，探討了神經(jīng)元中經(jīng)典MHCⅠ類分子內(nèi)源性以及神經(jīng)電活動誘導(dǎo)性表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，獲得如下結(jié)果:
　　1.經(jīng)典HLAⅠ類重鏈分子在人類胚胎發(fā)育中后期表達(dá)具有時空特異性，其中在小腦皮層部位主要表達(dá)于浦肯野細(xì)胞，且表達(dá)呈現(xiàn)由無或微弱表達(dá)逐漸增強(qiáng)再逐漸減弱的趨勢:胚胎21周即可檢測到極微弱的表達(dá)，到30周時呈強(qiáng)陽性表達(dá)，出生后表達(dá)

4、顯著減弱，成人不表達(dá)。經(jīng)典HLAⅠ類輕鏈分子β2m具有與其重鏈分子相類似的表達(dá)模式，且共定位于浦肯野細(xì)胞，提示它們可能以復(fù)合體形式表達(dá)于浦肯野細(xì)胞上。
　　2.出生后前3周為C57BL/6J小鼠小腦及海馬發(fā)育成熟的關(guān)鍵時期。免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測結(jié)果顯示在這一時期內(nèi)MHCⅠ類分子主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞，而并不表達(dá)于GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。在小鼠小腦部位，經(jīng)典MHCⅠ類分子主要表達(dá)于皮層浦肯野細(xì)胞層，進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CaBP

5、陽性浦肯野細(xì)胞上經(jīng)典MHCⅠ類分子的表達(dá)量，結(jié)果顯示其表達(dá)呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢，即P0期可檢測到弱表達(dá)，隨著發(fā)育的進(jìn)行表達(dá)逐漸增強(qiáng)，到P15時達(dá)到最強(qiáng)，隨后表達(dá)逐漸減弱。在海馬部位，經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)于錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及門區(qū)中間神經(jīng)元，通過RT-qPCR及Western Blot對其表達(dá)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示其表達(dá)同樣呈動態(tài)變化趨勢，即隨著發(fā)育的進(jìn)行表達(dá)逐漸增強(qiáng)，到P15時達(dá)到最強(qiáng)，P30時表達(dá)量顯著降低。此外，無論是海馬還是小腦

6、部位，經(jīng)典MHCⅠ類mRNA及蛋白的表達(dá)變化趨勢一致，提示我們發(fā)育過程中經(jīng)典MHCⅠ類分子的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。
　　3.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元表達(dá)經(jīng)典MHCⅠ類分子，但在體外發(fā)育過程中表達(dá)量并未發(fā)生顯著改變;相反，海因酸(Kainic acid，KA)刺激誘導(dǎo)神經(jīng)元興奮的條件下，經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)上調(diào)，使用100μM KA處理細(xì)胞30分鐘即可顯著誘導(dǎo)經(jīng)典MHCⅠ類分子的上調(diào)表達(dá)，并且蛋白與mRNA的表達(dá)變化趨勢一致，提示

7、神經(jīng)電活動誘導(dǎo)的經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。在功能上，KA誘導(dǎo)表達(dá)的神經(jīng)元MHCⅠ類分子具有負(fù)向調(diào)控突觸密度的作用，體現(xiàn)在KA刺激條件下興奮性突觸前marker蛋白Synaptophysin及突觸后marker蛋白PSD-95表達(dá)量顯著降低，加入MHCⅠ類分子抗體阻斷其信號傳導(dǎo)，則可部分挽救KA引起的這種改變。此外，KA可刺激神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞IMR-32、Neuro2a上調(diào)表達(dá)MHCⅠ類分子，與之相反，單核巨噬細(xì)胞白血

8、病細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞并不表達(dá)KA受體分子GRIK，KA刺激并不引起該細(xì)胞MHCⅠ類分子表達(dá)量的改變，提示KA誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞上調(diào)表達(dá)經(jīng)典MHCⅠ類分子具有特異性。
　　4.在體外，通過獲得不同DNA元件截短的突變質(zhì)粒，利用Luciferase Reporter Assay證實(shí)神經(jīng)元經(jīng)典MHCⅠ類分子啟動子區(qū)DNA元件enhancer A、IRSE和siteα均參與神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)源性及誘導(dǎo)性MHCⅠ類分子的表達(dá)。同時，分別與這些順

9、式元件有結(jié)合能力的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、IRF-1和CREB表達(dá)或活化水平受KA調(diào)控;在體內(nèi)，小鼠海馬發(fā)育過程中，IRF-1、NF-κB p-p65以及p-CREB的表達(dá)變化趨勢也與經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)變化趨勢一致;此外，在人類胎兒小腦發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄因子IRF-1表達(dá)變化趨勢幾乎與經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)變化趨勢一致。這些現(xiàn)象均提示這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與發(fā)育過程中以及KA誘導(dǎo)的經(jīng)典MHCⅠ類分子的表達(dá)調(diào)控。
　　5.神經(jīng)元興奮條件下可

10、通過Ca2+做為第二信使傳遞信號。在本實(shí)驗(yàn)條件下KA作用于離子型谷氨酸受體，可引起原代海馬神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+濃度的顯著增加，并且通過活化Ca+依賴的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)以及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)誘導(dǎo)MHCⅠ類分子的上調(diào)表達(dá)，體現(xiàn)在:使用PKA特異性抑制劑H89以及PKC特異性抑制劑staurosporine條件下，KA刺激引起的海馬神經(jīng)元MHCⅠ類分子的上調(diào)表達(dá)消失。其中

11、，PKA活化參與KA誘導(dǎo)的IRF-1上調(diào)表達(dá)，而PKC活化同時影響轉(zhuǎn)錄因子IRF-1表達(dá)以及NF-κB、CREB的活化程度。
　　6.KA刺激條件下，JAK1/STAT1、AKT以及MAPK等信號通路分子活化。其中，在PKC特異性抑制劑存在條件下，KA誘導(dǎo)的MAPK以及AKT信號通路活化消失，提示其可能作為PKC的下游信號參與KA誘導(dǎo)的經(jīng)典MHCⅠ類分子表達(dá)。
　　以上結(jié)果表明發(fā)育過程中MHCⅠ類分子主要在神經(jīng)元發(fā)育以及突觸