氟西汀改善腦缺血引起的空間學(xué)習(xí)記憶缺陷及其機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中(俗稱中風(fēng))為腦部血管阻塞或破裂引起腦部血流受阻所致病癥，是中老年人的常見病、多發(fā)病。流行病學(xué)調(diào)查顯示腦卒中存活者中有近30％的患者出現(xiàn)不同形式和程度的認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)為記憶障礙、定向力障礙、空間結(jié)構(gòu)能力障礙、推理思維能力障礙等。其中，記憶障礙者占45.4％。空間學(xué)習(xí)記憶障礙直接影響腦血管病的康復(fù)，已成為腦卒中研究的重點(diǎn)。 近年來，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均已經(jīng)證實(shí)成年哺乳動(dòng)物神經(jīng)元再生對(duì)缺血后腦功能的重建至關(guān)重要。空間學(xué)

2、習(xí)記憶主要依賴于海馬，因此海馬齒狀回(dtentate gyrus，DG)的神經(jīng)元再生對(duì)于學(xué)習(xí)記憶至關(guān)重要。大量的文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)局灶性腦缺血能夠激發(fā)成年哺乳動(dòng)物側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVz)以及海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生，新生神經(jīng)元能向損傷的腦區(qū)遷移而且可以整合到已有的神經(jīng)回路中形成一定的突觸聯(lián)系，這有利于改善缺血引起的神經(jīng)功能缺陷及海馬依賴性的學(xué)習(xí)記憶能力。這些研究均提示缺血后空間認(rèn)知損害可能通過增強(qiáng)海馬部

3、位的神經(jīng)元再生得到改善。 氟西汀被廣泛應(yīng)用于抗抑郁的治療，其主要作用是抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸間隙的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)再攝取。近年來的研究顯示，慢性的氟西汀治療在生理狀態(tài)下可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物海馬新生細(xì)胞的增殖和存活，然而，在腦缺血后慢性氟西汀治療能否增強(qiáng)神經(jīng)元再生從而改善空間學(xué)習(xí)記憶功能?為了探討這一問題，我們研究了小鼠局灶，}生腦缺血后慢性氟西汀治療對(duì)海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生及空間學(xué)習(xí)記憶缺陷

4、的影響，為中風(fēng)后空間認(rèn)知障礙提供了一個(gè)安全有效的治療方法。本文采用成年小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middlecerebral artery OCtlusion，MCAO)制備局灶性腦缺血再灌注模型，為研究腦缺血后學(xué)習(xí)記憶障礙提供一種較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 為了研究氟西汀對(duì)腦缺血后感覺運(yùn)動(dòng)功能及空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，實(shí)驗(yàn)共分為3組：假手術(shù)組-給予生理鹽水；溶劑對(duì)照組-MCAO造模后給予生理鹽水；氟西汀組-MCAO造模后給予氟西汀，在M

5、CAO造模后第8天開始給予氟西汀(10 mg/kg，腹腔注射，每日一次)，連續(xù)給藥28天至MCAO造模后第35天結(jié)束，同時(shí)假手術(shù)組及溶劑對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水。 在腦缺血造模后第7，14，21，28，35，42，49及59天分別進(jìn)行神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(Neurological severity scores，NSS)和足失誤測(cè)試(foot fault tests，F(xiàn)FT)來評(píng)價(jià)感覺運(yùn)動(dòng)功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：NsS實(shí)驗(yàn)中，各

6、個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)溶劑對(duì)照組小鼠神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，說明局灶性腦缺血能顯著損害小鼠的感覺運(yùn)動(dòng)功能；但在氟西汀組和溶劑對(duì)照組之間神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明慢性氟西汀治療對(duì)腦缺血后感覺運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)沒有影響。FFT實(shí)驗(yàn)是對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)中左右兩側(cè)前肢放置的協(xié)調(diào)性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組小鼠左右兩側(cè)前肢的失足率各約50％，氟西汀組及溶劑對(duì)照組小鼠缺血對(duì)側(cè)前肢失足比例均顯著增高，但這兩組之間沒有顯著性差異，這同樣

7、說明慢性氟西汀治療對(duì)腦缺血后運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能的恢復(fù)沒有影響。 在MCAO造模后第22-28天、50-59天即氟西汀治療兩周、四周后分別進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris water maze，MWM)檢測(cè)氟西汀對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。 在氟西汀治療兩周時(shí)，MWM隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)氟西汀組和溶劑對(duì)照組逃避潛伏期及游泳路線的長(zhǎng)度均顯著長(zhǎng)于假手術(shù)組；但氟西汀組和溶劑對(duì)照組之間沒有顯著性差異，同樣空間探索試驗(yàn)中氟西汀組和溶劑對(duì)照組

8、小鼠在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)亦均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明局灶性腦缺血導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受到損害，但氟西汀治療兩周對(duì)腦缺血引起的空間學(xué)習(xí)記憶損害沒有改’善作用。 氟西汀治療四周并停藥兩周后，MWM隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)氟西汀組逃避潛伏期和游泳路線的長(zhǎng)度顯著短于溶劑對(duì)照組，接近假手術(shù)組，說明慢性氟西汀治療能改善腦缺血后的空間學(xué)習(xí)記憶損害；并且在三組之間游泳速度沒有顯著差異，排除了動(dòng)物體力差異對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響；空間

9、探索試驗(yàn)中氟西汀組在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)均顯著多于溶劑對(duì)照組。為了排除視覺對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的影響進(jìn)行可視平臺(tái)試驗(yàn)，結(jié)果顯示三組的逃避潛伏期沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此排除了視覺障礙對(duì)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取小鼠腦組織進(jìn)行TTC染色顯示溶劑對(duì)照組與氟西汀組腦組織梗死面積的大小沒有顯著差異，以上研究結(jié)果說明慢性氟西汀治療對(duì)腦缺血后感覺運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)沒有影響，但能改善腦缺血后的空間學(xué)習(xí)記憶損害，且不

10、是由于梗死面積的縮小引起的。 為了研究海馬神經(jīng)元再生與氟西汀改善腦缺血后空間學(xué)習(xí)記憶功能之間的相互關(guān)系。 首先，我們觀察了氟西汀給藥對(duì)腦缺血后神經(jīng)元再生的影響，我們?cè)贛CAO造模后19-21天(氟西汀給藥后第12-14天)給予5-溴脫氧尿核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU：一種公認(rèn)的新生細(xì)胞標(biāo)記物)50mg/kg，連續(xù)給藥6次，給藥間隔為12小時(shí)，標(biāo)記新生細(xì)胞。最后一次BrdU注射24h和28

11、天后處死動(dòng)物，觀察氟西汀是否調(diào)控海馬DG區(qū)細(xì)胞的增殖和存活。BrdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明：三組之間缺血側(cè)及對(duì)側(cè)新生細(xì)胞的數(shù)目均沒有顯著差異，但氟西汀組缺血側(cè)及對(duì)側(cè)存活的細(xì)胞數(shù)與溶劑對(duì)照組相比，均顯著增多，對(duì)照組和假手術(shù)組之間存活的細(xì)胞數(shù)沒有差異，說明慢性氟西汀治療對(duì)缺血后海馬DG區(qū)神經(jīng)元的增殖沒有影響，但能促進(jìn)新生細(xì)胞的存活。 其次，為了進(jìn)一步探討氟西汀改善腦缺血后空間學(xué)習(xí)記憶功能是否依賴于海馬神經(jīng)元再生，我們運(yùn)用端粒酶抑制劑3

12、-疊氮脫氧胸苷(3’-azido-3’-deoxytllymidine，AZT)阻斷海馬神經(jīng)元再生。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，在生理狀態(tài)下，端粒酶抑制劑AZT顯著抑制了小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元的增殖及存活。造模后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為三組：溶劑對(duì)照組-MCAO造模后給予生理鹽水；氟西汀組(FLX組）-MCAO造模后給予氟西??；FLX+AZT組-MCAO造模后先給予AZT半小時(shí)后再給予氟西汀，小鼠氟西汀給藥前半小時(shí)(MCAO后8-35天)腹腔注射AZT(

13、100mg/kg，給藥28次，間隔24小時(shí))，第19-21天給予BrdU(50mg/kg，連續(xù)給藥6次，給藥間隔為12小時(shí))標(biāo)記新生細(xì)胞。末次BrdU注射28天后檢測(cè)海馬神經(jīng)元再生，并進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果顯示：氟西汀治療前半小時(shí)給予AZT，能夠削弱氟西汀誘導(dǎo)的缺血后DG區(qū)神經(jīng)元再生的上調(diào)，F(xiàn)LX+AZT組缺血側(cè)及對(duì)側(cè)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)分別比FLX組減少了46％和37％，接近溶劑對(duì)照組。且在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)

14、中與FLX組、溶劑對(duì)照組相比，F(xiàn)LX+AZT組逃避潛伏期及游泳路線的長(zhǎng)度均顯著延長(zhǎng)，以上結(jié)果說明AZT能夠削弱氟西汀誘導(dǎo)的缺血后DG區(qū)神經(jīng)元再生的上調(diào)，且此時(shí)氟西汀改善缺血后空間記憶損害的效應(yīng)消失。 結(jié)論：慢性氟西汀治療對(duì)腦缺血后感覺運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)沒有影響：腦缺血后慢性氟西汀治療不影響海馬DG區(qū)神經(jīng)元的增殖，但能夠促進(jìn)新生細(xì)胞的存活，并逆轉(zhuǎn)缺血引起的空間學(xué)習(xí)記憶損害。海馬神經(jīng)元再生的上調(diào)是氟西汀改善缺血后空間學(xué)習(xí)記憶損害所必需的