氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)藥代動力學及藥效學研究.pdf

1、水產(chǎn)藥物殘留問題普遍存在，給人類健康和環(huán)境帶來了很大的危害。進入養(yǎng)殖環(huán)境的抗菌藥物可引起養(yǎng)殖生物自身和養(yǎng)殖水環(huán)境中耐藥細菌和耐藥基因的產(chǎn)生，破壞生態(tài)平衡，威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的可持續(xù)安全；同時養(yǎng)殖生物體內(nèi)殘留的漁藥和某些耐藥細菌及耐藥基因可通過食物鏈的傳遞進入人體，給人類健康帶來潛在的威脅。
　　氟苯尼考以其高效、吸收迅速、分布廣泛等優(yōu)點，作為氯霉素替代物，用于近海養(yǎng)殖中，尤其是在蝦類養(yǎng)殖及育苗中的廣泛使用。然而，由此引起的氟苯尼考殘

2、留現(xiàn)象及細菌耐藥性不斷產(chǎn)生并呈現(xiàn)逐年攀升現(xiàn)象。因此，進行水產(chǎn)品氟苯尼考藥殘危害和海水源弧菌對氟苯尼考的耐藥性監(jiān)測研究迫在眉睫。脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是我國新興的海水養(yǎng)殖品種發(fā)展迅速，其作為與魚蟹貝類等混養(yǎng)的重要經(jīng)濟蝦類，顯示出良好的養(yǎng)殖前景。本課題以脊尾白蝦為研究對象，研究了不同溫度、不同給藥方式下氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥代動力學特征；測定了給藥劑量下氟苯尼考在脊尾白蝦各組織中的殘留規(guī)律；以脊尾白蝦

3、解剖學參數(shù)和氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥殘參數(shù)構建了氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)殘留的PBPK模型，以凡納濱對蝦相關數(shù)據(jù)進行模型參數(shù)優(yōu)化并進行種間類推；進行了氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥效和危害評價；檢測了三種不同養(yǎng)殖模式蝦池中弧菌對氟苯尼考的耐藥性水平。本論文研究內(nèi)容共分為以下六部分：
　　1.不同溫度和給藥方式下氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥代動力學比較
　　在水溫(22±0.4)℃和(28±0.3)℃條件下，分別以10 mg/(kg

4、·BW)和30 mg/(kg·BW)給藥劑量經(jīng)肌注和口服氟苯尼考后，用高效液相色譜(HPLC)法測定了脊尾白蝦各組織中氟苯尼考濃度，通過 DAS2.0藥動學軟件對氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的血藥濃度進行分析，擬合出藥動曲線方程，比較不同水溫和給藥方式下氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥動學差異，并給出不同水溫條件下的給藥方案。結果可知，不同水溫條件下健康脊尾白蝦肌注給藥時，氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)均符合零級吸收二室開放模型，動力學方程為：Ct肌注22

5、℃=5.362e-0.69t+2.53e-0.038t和 Ct肌注28℃=12.466e-1.569t+4.417e-0.065t；口服給藥時，氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)均符合一級吸收二室開放模型，動力學方程為：Ct口服22℃=5.753e-0.191t+0.704e-0.036t-6.457e-1.743t和 Ct口服28℃=2.337e-0.442t+3.802e-0.061t-6.139e-40.223 t。在相同的給藥方式，不同水溫

6、條件下，氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的代謝差異較大：肌注給藥方式下，在22℃時氟苯尼考在脊尾白蝦血漿中Cmax(9.44μg/mL)和AUC0~t(75.779 h·mg/L)小于28℃水溫(16.79μg/mL和80.81 h·mg/L)，且t1/2α(1.004 h)和t1/2β(18.26 h)長于28℃水溫(0.442 h和10.648 h)；口服給藥方式下，表現(xiàn)出相似特征，在22℃時氟苯尼考在脊尾白蝦血漿中Cmax(4.87μg/m

7、g)、AUC0~t(47.795 h·mg/L)和F(21.02％)小于28℃水溫(6.99μg/mL、70.288 h·mg/L和28.99%)，且tmax(1 h)、t1/2Kα(0.398 h)、t1/2α(3.623 h)和t1/2β(19.038 h)長于28℃水溫(0.5 h、0.017 h、1.569 h和11.358 h)。在相同水溫條件，不同給藥方式下，氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的代謝差異也較大：在22℃時肌注給藥方式下，

8、氟苯尼考在脊尾白蝦血漿中 Cmax(9.44μg/mL)和 AUC0~t(75.779 h·mg/L)大于口服給藥(4.87μg/mg和47.795 h·mg/L)，且t1/2α(1.004 h)和t1/2β(18.26 h)短于口服給藥(3.623 h和19.038 h)；在28℃水溫不同給藥方式下，也表現(xiàn)出相似特征。結果表明：氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)吸收迅速，分布較廣，但消除緩慢，生物利用度不高。兩種給藥方式下，肌注給藥時氟苯尼考在脊

9、尾白蝦體內(nèi)的吸收、分布和消除速率均快于口服給藥；不同水溫條件下，28℃時氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的吸收、分布和消除速率快于22℃條件下，且28℃條件下氟苯尼考的生物利用度也較高。實際水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中生產(chǎn)中氟苯尼考的使用要考慮到水溫，本實驗建議，28℃水溫時，脊尾白蝦口服給藥劑量為33.67 mg/(kg·BW)，給藥間隔為9.2 h；22℃水溫時，脊尾白蝦口服給藥劑量為25.46 mg/(kg·BW)，給藥間隔為10.8 h。
　

10、　2.氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的殘留消除規(guī)律研究
　　在水溫(22±0.4)℃條件下，分別以10、20和40 mg/(kg·BW)氟苯尼考給藥劑量連續(xù)投喂脊尾白蝦5 d，分別于最后一次給藥后的1、2、3、4、5、7、10、15和20 d隨機挑選脊尾白蝦取血淋巴、肝胰腺、腸、鰓、肌肉和甲殼組織樣品，通過HPLC法測定脊尾白蝦各組織中氟苯尼考濃度，研究氟苯尼考在脊尾白蝦各組織中的殘留消除規(guī)律。結果表明：給藥結束后第1 d各組織中氟苯尼考

11、的濃度由高到低分別是肝胰腺>腸>血淋巴>肌肉≈鰓>甲殼。同時氟苯尼考濃度在各個組織中具有明顯的劑量效應，同時其濃度隨著時間的延長逐漸減小。三種給藥劑量下，氟苯尼考在血淋巴中的消除半衰期最短，在腸中消除半衰期最長，且消除半衰期與給藥劑量無關。為滿足食品安全準則氟苯尼考的最高殘留限量0.1μg/g，本實驗條件下推薦氟苯尼考在脊尾白蝦養(yǎng)殖中的休藥期為7d以上。
　　3.氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的PBPK模型構建和參數(shù)優(yōu)化校正
　　假

12、設氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)以原藥形式存在，在肝胰腺中的清除符合一級動力學方程。根據(jù)脊尾白蝦的生理解剖學參數(shù)和第2部分氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)殘留數(shù)據(jù)結果，設計了包含肝胰腺、肌肉、鰓、甲殼和其他等5大模塊的模型結構，建立了氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)殘留的PBPK模型，對其進行參數(shù)優(yōu)化校正以及靈敏性分析，比較了模型預測值與實測值的相關性和吻合程度；并嘗試將PBPK模型外推至凡納濱對蝦，用凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)藥殘數(shù)據(jù)

13、驗證PBPK模型對藥物殘留預測的有效性。結果表明：各模塊器官容積和肝胰腺清除率參數(shù)對模型靈敏性影響最大，PBPK模型擬合的氟苯尼考殘留濃度預測值與實測值吻合較好，能夠準確反映氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的殘留消除情況；同時，PBPK模型外推至凡納濱對蝦時，可以準確地預測氟苯尼考的殘留情況。說明本研究構建的氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)殘留的PBPK模型預測藥物殘留能力具有較高的可信度，這為我國開展甲殼動物藥殘預測以及風險評估提供一定的科學依據(jù)。

14、>　　4.氟苯尼考在感染副溶血弧菌的脊尾白蝦體內(nèi)的藥效學
　　在水溫(20±0.5)℃條件下，設立空白對照組（不攻菌不給藥）、肝損傷對照組（攻菌不給藥）、氟苯尼考低劑量組(10 mg/(kg·BW))、中劑量組(20 mg/(kg·BW))、高劑量組(40 mg/(kg·BW))。給藥開始前，肝損傷對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染1次誘發(fā)肝胰腺損傷，構建病理模

15、型，空白對照組注射同體積PBS無菌緩沖液。同時空白對照組和肝損傷對照組投喂不含藥物的基礎飼料，低、中和高劑量組分別連續(xù)投喂10 mg/(kg·BW)、20 mg/(kg·BW)和40 mg/(kg·BW)的氟苯尼考藥餌5 d，停藥后觀察一周至12 d。實驗過程中記錄各組發(fā)病情況和死亡率，并于感染后1、3、5和12 d取血淋巴和肝胰腺測定細菌數(shù)量的變化情況。于感染后12 h(0.5 d)，感染后連續(xù)給藥5 d以及停藥觀察至12 d從各組隨

16、機選取10尾脊尾白蝦，對肝胰腺進行外觀形態(tài)觀察和記錄，并分別隨機取3尾蝦的肝胰腺進行病理學鏡檢。結果顯示：感染副溶血弧菌5d后，空白對照組和肝損傷對照組累計死亡率分別為0和65.01％，表明疾病模型構建成功；而氟苯尼考低劑量組、中劑量組和高劑量組累計死亡率分別為58%、51%和45.35%，各組之間差異顯著。直至12 d實驗結束時，與肝損傷對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組的存活率分別提高了7.01%、14.01%和19.66%，

17、各組之間差異顯著。除空白對照組外，實驗期間各組血淋巴和肝胰腺中細菌含量呈下降趨勢。在第12 d實驗結束時，低劑量組、中劑量組和高劑量組中血淋巴和肝胰腺細菌含量分別為1.73×102 CFU/ml、0、0和2.81×102 CFU/g、1.13×102 CFU/g、0，與空白對照組差異不顯著。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，各實驗組肝小管細胞腫脹、空泡比例和破損程度降低。實驗結果表明，氟苯尼考對副溶血弧菌感染的脊尾白蝦具有良好的防治作用，可用于防治蝦類

18、弧菌性疾病。
　　5.氟苯尼考對脊尾白蝦免疫-抗氧化酶活性的影響
　　在水溫(20±0.5)℃條件下，設立對照組，氟苯尼考組(10 mg/(kg·BW))、中劑量組(20 mg/(kg·BW))、高劑量組(40 mg/(kg·BW))。低、中和高劑量組分別連續(xù)投喂10 mg/(kg·BW)、20 mg/(kg·BW)和40 mg/(kg·BW)的氟苯尼考藥餌5 d，對照組投喂基礎飼料。于停止投喂藥餌后的第3、6、12、24、

19、48、96、168和240 h取血淋巴，測定HEM含量、ACP、AKP、T-SOD、CAT和T-AOC等指標的變化情況。結果顯示：10 mg/(kg·BW)組和20 mg/(kg·BW)組HEM含量均在3 h時間點顯著高于對照組，40 mg/(kg·BW)組在3-48 h時間點顯著高于對照組；10 mg/(kg·BW)組和20 mg/(kg·BW)組ACP活性在3和6 h時間點顯著高于對照組，40 mg/(kg·BW)組在3-168 h

20、時間點顯著低于其他三組；10 mg/(kg·BW)組和20 mg/(kg·BW)組AKP活性在3 h時間點均顯著高于對照組，6-48 h時間點顯著低于對照組，40 mg/(kg·BW)組在3-48 h時間點顯著低于對照組；10 mg/(kg·BW)組和20 mg/(kg·BW)組T-SOD活性整體高于對照組，分別在6 h和24 h時間點達到最高值，40 mg/(kg·BW)組在24和48 h時間點顯著低于對照組；三劑量組CAT活性均在3

21、和6 h時間點顯著高于對照組，之后在12-96 h時間點顯著低于對照組，于24 h時間點達到最低值；三劑量組T-AOC活性均在3-96 h時間點顯著低于對照組，于48 h時間點達到最低值，且出現(xiàn)劑量效應。結果表明：本實驗所用氟苯尼考三種劑量對脊尾白蝦免疫-抗氧化功能具有一定的影響作用。10 mg/(kg·BW)和20 mg/(kg·BW)氟苯尼考對脊尾白蝦免疫-抗氧化酶活力具有一定誘導作用，而40 mg/(kg·BW)則表現(xiàn)出抑制效應。

22、本研究結果為氟苯尼考在海水養(yǎng)殖實際生產(chǎn)中使用的安全評估提供了科學的數(shù)據(jù)支持。
　　6.三種不同養(yǎng)殖模式蝦池弧菌對氟苯尼考耐藥性研究
　　自2016年5月-2016年11月，針對蝦類三種不同養(yǎng)殖模式地區(qū)：山東日照海辰水產(chǎn)有限公司魚蝦蟹貝混養(yǎng)養(yǎng)殖池塘、山東濰坊新大地水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖池和山東青島卓越海洋集團有限公司工廠化換水養(yǎng)殖池的水樣進行弧菌的分離純化培養(yǎng)、鑒定及保存；以藥敏紙片法和微量肉湯稀釋法對收集的弧菌進行

23、了氟苯尼考的耐藥性檢測；檢測了氟苯尼考耐藥相關基因（floR和 cfr基因）和整合子-基因盒的攜帶情況。結果顯示：從日照、濰坊和青島三地共分離到20種142株弧菌，其中日照地區(qū)分離出18種69株、濰坊地區(qū)分離出9種56株，青島地區(qū)分離出4種17株。其中以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)菌株最多，分別為37株和31株，共占分離株總數(shù)的47.89%。藥敏紙片法和微量肉湯稀釋法檢測

24、共分離出耐藥菌株21株，耐藥率為14.79％。日照對氟苯尼考耐藥菌株有7株，耐藥率為10.14％；濰坊對氟苯尼考耐藥菌株有13株，耐藥率為23.21％；青島對氟苯尼考耐藥菌株有1株，耐藥率5.88％。通過測序分析發(fā)現(xiàn)鑒定的142株弧菌中floR基因陽性菌株共有27株，陽性率為19.01％，其中日照有10株，濰坊15株，青島2株；142株弧菌均未檢測到cfr基因。在表型耐藥的21株耐氟苯尼考菌株中有6株含有完整的整合子的保守區(qū)，檢出率為2

25、8.57%，其中菌株R-3（燦爛弧菌Vibrio splendidus）和R-5（嗜環(huán)弧菌Vibrio cyclitrophicus）的int1可變區(qū)還攜帶有基因盒，均為arr-3-dfrA27基因盒，陽性率為9.52%。此外，菌株R-17（溶藻弧菌）可檢測到 ISCR元件可變區(qū)攜帶的dhfr耐藥基因盒。結果表明，這三種養(yǎng)殖模式中，魚蝦蟹貝混養(yǎng)池塘養(yǎng)殖模式含有的弧菌種類和數(shù)量最多，工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式次之，工廠化換水養(yǎng)殖模式最少；而工廠