唐古特瑞香、鬼臼、淫羊藿內(nèi)生真菌的分離純化及發(fā)酵產(chǎn)物活性研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌與宿主植物長期互惠共生，能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的化學(xué)成分。它們在植物內(nèi)廣泛存在，并且表現(xiàn)出豐富的物種和代謝產(chǎn)物多樣性，可以認為是在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景和潛力的化合物庫。鑒于此，本文選擇唐古特瑞香（Daphne tangutica Maxi.）、鬼臼（Sinopodophyllum hexandrum(Royle) Ying）、淫羊藿（Epimedium brevicornum Maxim.）三種藥用植物作為

2、材料，對其內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的生物活性進行研究。
　　采用組織塊分離法，從唐古特瑞香、鬼臼、淫羊藿的莖部分離得到30株內(nèi)生真菌，這些菌株菌落形態(tài)多樣，生長特點各有不同。通過菌落形態(tài)觀察和顯微觀察，并對照《真菌鑒定手冊》，共鑒定出其中的9株。9株內(nèi)生真菌分屬于短梗梭孢霉屬（Fusoma）、交鏈孢霉屬（Alternaria）、單端孢霉屬（Didymopsis）、梨形孢屬（Piricularia）、頭孢霉屬（Cephalosporiu

3、m）、串珠霉屬（Moniliara）、曲霉屬（Aspergillus）和鐮刀菌屬（Fusarium）。
　　對從唐古特瑞香、鬼臼、淫羊藿三種藥用植物的莖部分離得到的共計30株內(nèi)生真菌進行了發(fā)酵并對發(fā)酵物進行了處理，得到其發(fā)酵液乙酸乙酯、正丁醇萃取物及菌絲體甲醇提取物共計90個樣品，對90個樣品的抑菌、抗氧化和α-糖苷酶抑制活性進行了篩選研究。
　　抑菌實驗采用濾紙片法。結(jié)果表明：RX-S-102菌株的乙酸乙酯萃取物在濃度為1

4、0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌（S. au）、地衣芽孢桿菌（B. lic）、大腸桿菌（E. coli）、綠膿桿菌（P. ae）和肺炎克雷伯菌（K. pn）五種指示菌均表現(xiàn)出很強（22mm<抑菌圈直徑≤28mm）的抑制活性，抑菌圈直徑范圍達到22.3~28.0mm，進一步最小抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果顯示其對上述五種指示菌的最小抑菌濃度范圍為0.025~0.100 mg/mL；同時，RX-S-105菌株乙酸乙酯萃取物對地衣芽孢桿菌（B

5、. lic）和肺炎克雷伯菌（K. pn）兩種指示菌、GJ-S-208菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌（S. au）、GJ-S-203菌株菌絲體甲醇提取物對地衣芽孢桿菌（B. lic）、YYH-S-301菌株正丁醇萃取物對大腸桿菌（E. coli）均表現(xiàn)出強（16mm<抑菌圈直徑≤22mm）的抑制活性；此外，在全部90個樣品中，僅RX-S-106菌株發(fā)酵液正丁醇萃取物對全部5種指示菌均未顯示出明顯的抑制活性。
　　抗氧化實驗

6、分別采用鐵氰化鉀還原法、水楊酸法和DPPH自由基清除法（樣品濃度均為0.1 mg/mL）。結(jié)果表明：在總還原力的測定中，樣品中維生素C相當含量（Vc當量）超過300μg/mg的有6個，其中RX-S-104、GJ-S-203和YYH-S-304菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的Vc當量分別達到973.39μg/mg、735.08μg/mg和710.39μg/mg，Vc及上述三個樣品進一步EC50值測定結(jié)果分別為0.1164 mg/mL、0.126

7、6 mg/mL、0.1732 mg/mL、0.1796 mg/mL；樣品對羥自由基清除率均未超過50%，且未發(fā)現(xiàn)有在相同濃度下對羥基自由基的清除率超過Vc的樣品，相同濃度下Vc對羥基自由基的清除率為46.83%；12個樣品的DPPH自由基清除率大于80%，其中，GJ-S-208菌絲體甲醇提取物和GJ-S-209菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對DPPH自由基的清除率分別為92.79%和90.26%，Vc及上述兩個樣品進一步IC50測定結(jié)果分別為

8、0.0054 mg/mL、0.0541 mg/mL、0.0563 mg/mL。
　　α-糖苷酶抑制活性實驗采用改良后的 PNPG法（樣品濃度均為1 mg/mL）。結(jié)果表明：90個樣品對α-糖苷酶均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，抑制率超過80%的樣品共有35個，其中，對α-糖苷酶抑制率超過90%的樣品共有7個；相同濃度下，拜糖平對α-糖苷酶的抑制率為99.71%。
　　進一步對高活性菌株RX-S-102進行大量發(fā)酵并采用硅膠柱色譜