RANTES-CCL5天然突變體S24F在心臟移植排斥反應(yīng)中的作用及機制研究.pdf

1、本文分三個部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：RANTES/CCL5天然突變體S24F基因重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定
　　目的:構(gòu)建攜帶天然RANTES/CCL5突變體S24F基因的重組腺病毒載體，制備能表達(dá)S24F蛋白的重組腺病毒，為體/內(nèi)外干預(yù)移植排斥反應(yīng)奠定研究基礎(chǔ)。
　　方法:根據(jù)Capoulade-Metay文獻(xiàn)報告，按照序列信息通過化學(xué)合成法，設(shè)計合成目的基因S24F。BamHI、EcoRI限制性內(nèi)切酶對化學(xué)合成

2、的目的基因S24F及穿梭載體pAV-MCMV-GFP-3FLAG進(jìn)行酶切，用試劑盒對線性化的載體片段進(jìn)行回收。目的基因片段與線性化的載體同源重組，將產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送公司測序。對測序?qū)Ρ葴?zhǔn)確的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。采用AdMaxTM腺病毒包裝系統(tǒng)，將攜帶S24F基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAV-MCMV-S24F-GFP-3FLAG與攜帶了腺病毒大部分基因組的輔助包裝質(zhì)粒pBHGloxΔE1,

3、3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過Cre/loxP重組酶系統(tǒng)的作用完成重組，產(chǎn)生重組腺病毒Adeno-S24F-GFP-3FLAG（Ad-S24F），利用氯化銫兩步法超速離心法純化及凍存，對照腺病毒Adeno-GFP（Ad-Null）不含目的基因與標(biāo)簽蛋白FLAG，僅含GFP。Titer-EZ腺病毒滴度檢測試劑盒測定病毒滴度，免疫熒光及Western Blot檢測S24F融合蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:腺病毒穿梭質(zhì)粒pAV-MCMV/

4、S24F-GFP-3FLAG酶切鑒定正確，陽性克隆測序結(jié)果與S24F基因庫中的序列完全相符，Titer-EZ腺病毒滴度檢測試劑盒測定目的重組腺病毒Adeno-S24F-GFP-3FLAG滴度為7.10×1011 PFU/mL，對照病毒Adeno-GFP（Ad-Null）為2.00×1011 PFU/mL，免疫熒光及Western Blot鑒定Ad-S24F腺病毒表達(dá)載體成功攜帶目的基因并表達(dá)S24F融合蛋白。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建攜

5、帶天然RANTES/CCL5突變體 S24F基因的重組腺病毒Ad-S24F及空質(zhì)粒對照病毒Ad-Null，并在293T細(xì)胞中高效表達(dá)，為體/內(nèi)外干預(yù)移植排斥反應(yīng)奠定研究基礎(chǔ)，并具有一定的應(yīng)用價值。
　　第二部分：腺病毒介導(dǎo)S24F基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對RANTES趨化功能的影響
　　目的:檢測Ad-S24F轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后S24F蛋白的表達(dá)，探討腺病毒介導(dǎo)S24F基因轉(zhuǎn)染HUVECs對RANTES趨化作用的影響，為

6、進(jìn)一步研究S24F的功能提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:參照J(rèn)affe的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）培養(yǎng)方法并加以改進(jìn)，分離培養(yǎng)HUVECs，體外經(jīng)腺病毒Ad-S24F及Ad-Null分別轉(zhuǎn)染48小時，利用熒光顯微鏡及Western Blot檢測S24F融合蛋白在HUVECs表達(dá)并利用CCK-8試劑盒評估轉(zhuǎn)染效率及最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI）。分離人外周血單個核細(xì)胞（PBMCs），并采用Tranwell小室法分析S24F融合蛋白對RANT

7、ES趨化功能的影響。
　　結(jié)果:（1）Ad-S24F及Ad-Null成功轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，熒光顯微鏡及Western Blot分別能檢測到重組蛋白表達(dá)，MOI20時為最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到95％左右。MOI在80以下時，隨著病毒數(shù)的提高轉(zhuǎn)染效率相應(yīng)微弱提高，轉(zhuǎn)染后HUVECs存活率無明顯差異P<0.05；MOI在80以上時轉(zhuǎn)染效率相應(yīng)提高，但轉(zhuǎn)染后HUVECs存活率明顯下降。（2）Ad-S24F轉(zhuǎn)染HUVECs48小時后免

8、疫熒光顯示強烈紅色熒光表達(dá)（S24F）及綠色GFP熒光蛋白表達(dá)，而對照病毒僅表達(dá)綠色熒光蛋白無S24F蛋白表達(dá)，空白對照組無任何熒光表達(dá)。（3）Ad-S24F轉(zhuǎn)染HUVECs表達(dá)S24F能夠抑制RANTES誘導(dǎo)的PBMCs穿內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用。
　　結(jié)論:Ad-S24F及Ad-Null能成功轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并表達(dá)所含目的蛋白，腺病毒介導(dǎo)S24F基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能夠抑制RANTES的趨化作用，為下一步在體實驗提供理論依

9、據(jù)及數(shù)據(jù)支持。
　　第三部分：腺病毒介導(dǎo)S24F基因轉(zhuǎn)染延長同種異體小鼠心臟移植物生存時間及其機制探討
　　目的:應(yīng)用小鼠同種異基因腹部異位心臟移植模型研究S24F對移植心臟的存活時間、炎性細(xì)胞的浸潤情況、促炎相關(guān)因子表達(dá)的影響及其機制探討。
　　方法:以BALB/c小鼠為供體，C57BL/6J小鼠為受體，分別經(jīng)供體主動脈根部順行灌注腺病毒液Ad-S24F(1×109 PFU), Ad-Null(1×109PFU)和無

10、菌PBS液200μL，4℃肝素鹽水保存30分鐘后，再建立小鼠腹部異位心臟移植模型，每天通過腹部觸摸確定移植心臟跳動，以移植心臟停止跳動為觀察時間終點，記錄移植心臟存活時間。BALB/c及C57BL/6J小鼠各90只，分別隨機分為三組：空白對照組；Ad-Null轉(zhuǎn)染組；Ad-S24F轉(zhuǎn)染組。Ad-S24F轉(zhuǎn)染組為45對，空白對照組及Ad-Null轉(zhuǎn)染組分別為20對和25對，分別于腺病毒轉(zhuǎn)染移植心臟，移植術(shù)后3天、5天、7天、9天、11天和

11、14天獲取受體C57BL/6J小鼠血清及供心，每個時間點4只，利用Western Blot檢測S24F蛋白表達(dá)在移植心臟及供體血清中的表達(dá)量及持續(xù)時間，HE切片觀察炎癥相關(guān)細(xì)胞在移植心臟的浸潤情況。移植術(shù)后6天行免疫組織化學(xué)檢測CD4+, CD8+,MOMA,和T細(xì)胞受體(TCR)αβ+細(xì)胞在移植心臟的表達(dá)，同時通過qRT-PCR和Western Blot檢測RANTES、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、TGF-β、CCR1、CCR

12、3、CCR5、STAT1α、P-STAT1和IRF-1的mRNA和蛋白表達(dá)，以探索S24F在心臟移植排斥的角色及作用機制。
　　結(jié)果:（1）Ad-S24F及Ad-Null轉(zhuǎn)染后的移植心臟呈現(xiàn)強烈的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)，Ad-S24F轉(zhuǎn)染后的血清及移植心臟的Western Blot顯示S24F在轉(zhuǎn)染心臟后3-5天為表達(dá)高峰，2周左右下降至接近基線水平；Ad-Null轉(zhuǎn)染后的血清及移植心臟僅可見GFP表達(dá)，未見S24F蛋白表達(dá)。（2

13、）經(jīng)供體主動脈根部順行灌注腺病毒液Ad-S24F組移植心臟存活時間為13.00±0.33天，相比較Ad-Null組及PBS液組（9.38±0.60天，9.00±0.38天），P<0.05有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。（3）利用免疫組織化學(xué)平均光密度法（IOD）分析,轉(zhuǎn)染Ad-S24F組與對照組比較，CD8+,MOMA和TCR-αβ+細(xì)胞在移植心臟的表達(dá)明顯減低，而CD4+淋巴細(xì)胞的表達(dá)并無明顯不同。（4）利用qRT-PCR和Western Blot

14、分析,轉(zhuǎn)染Ad-S24F組與對照組比較，移植心臟中RANTES、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、CCR1、CCR3、CCR5、STAT1α、P-STAT1和IRF-1的mRNA及蛋白表達(dá)下降，而TGF-β表達(dá)有微弱增加。
　　結(jié)論:同種異基因心臟移植后出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，移植物中 RANTES、IFN-γ、IL-1β、TNF-α等主要炎癥細(xì)胞因子水平上調(diào)并激活 RANTES/CCR和JAK/STAT1α信號通路；而誘導(dǎo)移植心臟過

15、表達(dá)RANTES的天然突變體S24F首先可競爭性抑制RANTES與CCR1、CCR3、CCR5結(jié)合并使受體表達(dá)下調(diào)；其次抑制JAK/STAT1α信號通路激活，抑制STAT1α和IRF-1的激活及磷酸化而下調(diào)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平，減輕炎癥細(xì)胞在移植物中的浸潤，從而延長移植存活時間，這說明S24F在移植排斥反應(yīng)的病程中是通過競爭性結(jié)合并下調(diào)RANTES受體，抑制JAK/STAT1α信號通路而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。更為重要的是，這種天然存在于人