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文檔簡介
1、本研究旨在篩選溴甲烷土壤消毒的有效替代品,并探討快速有效的分子生物學(xué)方法定性定量研究土傳病原真菌,綜合評價土壤消毒的藥效,為土壤消毒防治土傳病害提供更為科學(xué)的依據(jù)。通過常規(guī)的病原菌分離培養(yǎng)方法分離重要的土傳病原真菌,采用改進(jìn)的冷凍研磨CTAB法提取基因組DNA,對真菌核糖體基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,ITS)進(jìn)行克隆測序,設(shè)計特異性引物,并進(jìn)行引物特異性及靈敏性檢驗。根據(jù)所設(shè)計的特異性引物,采
2、用實時熒光定量PCR方法對硫酰氟處理后土樣中病原真菌進(jìn)行定性定量研究,并結(jié)合病原菌傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)的方法,綜合評價硫酰氟土壤消毒對土傳病原真菌的控制效果。通過本研究,得到如下結(jié)果: (1)采用不同劑量的硫酰氟室內(nèi)土壤熏蒸,結(jié)果表明硫酰氟用量在5.44×10-2g/L~43.52×10-2g/L對土壤中尖鐮刀菌有很好的防效,與本室所做的硫酰氟田間藥效試驗結(jié)果相一致,說明硫酰氟是很有潛力的土壤熏蒸劑。 (2)從采集的保護(hù)地病土與
3、典型病組織中成功分離到辣椒疫霉,番茄晚疫病菌,尖鐮刀菌,瓜果腐霉,鏈格孢。并收集培養(yǎng)了寄生疫霉,苧麻疫霉,棉尖鐮孢,燕麥鐮孢,串珠鐮孢,禾谷鐮孢,腐皮鐮孢,大麗輪枝菌,番茄灰霉等菌株。 (3)對冷凍研磨CTAB法進(jìn)行改進(jìn)后,成功提取多種真菌的基因組DNA。并對腐皮鐮孢,分離的鐮刀菌,辣椒疫霉,番茄晚疫病菌,大麗輪枝菌,瓜果腐霉的ITS區(qū)進(jìn)行克隆測序,結(jié)果顯示其長度分別為544bp,544bp,793bp,884pb,541bp,
4、866bp。經(jīng)序列比對,結(jié)果顯示腐皮鐮刀菌和分離的鐮刀菌均與尖鐮刀菌的一個專化型Fusariumoxysporumf.sp.meloni同源性高達(dá)99%以上,推測它們的分類地位可能都應(yīng)歸屬于Fusariumoxysporumf.sp.meloni.其余菌株序列比對,結(jié)果顯示其種屬名均與GenBank中報道的一致。 (4)對分離的鐮刀菌,辣椒疫霉,大麗輪枝菌三種重要土傳病原真菌設(shè)計了特異性引物,kfu1/kfu2,ljym1/lj
5、ym2,dllz1/dllz2,并進(jìn)行引物的特異性及靈敏性檢驗,結(jié)果表明退火溫度均為65℃時,三對引物均具有良好的特異性和靈敏性。 (5)以不同劑量硫酰氟處理后的土樣為樣本,根據(jù)所設(shè)計的特異性引物,采用熒光定量PCR方法對土樣中病原真菌進(jìn)行定性定量研究。結(jié)果表明,可準(zhǔn)確定量不同處理土樣中尖鐮刀菌的rDNA拷貝數(shù),顯示硫酰氟對該菌有很好的控制效果,并明確了尖鐮刀菌是滿城草莓病害一個重要致病菌,初步形成了土傳病原真菌快速有效的分子檢
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