乙酰肝素酶在卵巢癌中的表達(dá)及與其血管生成、預(yù)后的關(guān)系.pdf

1、腫瘤細(xì)胞要實(shí)現(xiàn)其擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移，必須首先穿越由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)組成的屏障。該屏障主要由兩種成分構(gòu)成：一是結(jié)構(gòu)蛋白；二是糖氨聚糖，其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparinsulphateproteoglycan，HSPG)。乙酰肝素酶(heparanse，Hpa)是一種蛋白聚糖類碳水化合物，是基底膜的主要構(gòu)成成分，它能與細(xì)胞表面及ECM中的活性分子結(jié)合，粘附于細(xì)胞表面，是ECM聚集和穩(wěn)定的基礎(chǔ)。同時(shí)，Hpa是體內(nèi)唯

2、一能夠降解HSPG的內(nèi)切酶，通過降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜和促進(jìn)新生血管形成來加速腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。Hpa主要通過直接、間接兩種方式發(fā)揮促血管生成作用：①直接作用，Hpa可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞以生芽方式促進(jìn)血管生成；②間接作用，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放乙酰硫酸肝素鹽-堿性成纖維細(xì)胞生長因子(HS-bFGF)復(fù)合物和產(chǎn)生HS降解片段以促進(jìn)bFGF活性來間接誘發(fā)血管生成反應(yīng)。bFGF是一種強(qiáng)有力的促血管生成劑，對腫瘤間質(zhì)血管新生和侵襲起有重要作用

3、。 目前國內(nèi)外關(guān)于卵巢癌中Hpa的表達(dá)情況與其血管生成及臨床預(yù)后的研究很少，為此，本實(shí)驗(yàn)采用原位雜交及免疫組化技術(shù)，研究了Hpa在卵巢癌中的表達(dá)及其與卵巢癌中微血管密度(Microvesseldensity，MVD)、bFGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)合卵巢癌的臨床病理特征，初步探討卵巢癌中Hpa及其與其血管生成、預(yù)后的關(guān)系。為尋找卵巢癌新的診斷和治療途徑提供實(shí)驗(yàn)資料。 第一部分：乙酰肝素酶mRNA及蛋白在卵巢癌中的表達(dá)

4、 一、材料與方法 1.標(biāo)本來源 選取2003年1月-2005年11月在第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院、新橋醫(yī)院、大坪醫(yī)院手術(shù)切除的卵巢癌組織標(biāo)本41例(部分為卵巢癌標(biāo)本蠟塊)，其中漿液性囊腺癌22例、粘液性囊腺癌10例，其他9例。所有病例均經(jīng)病理學(xué)確診，手術(shù)前均未接受過化療及放療。選取同期正常卵巢組織(取自卵巢漿液性囊腫周邊的正常卵巢組織)10例作為正常對照。選取第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院一例惡性黑色素瘤(膽囊)組織作為陽性對

5、照。 2.實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及方法 2.1.原位雜交法檢測卵巢癌中HpamRNA的表達(dá)。 2.2.免疫組化S-P法檢測同一標(biāo)本連續(xù)切片中Hpa蛋白的表達(dá)和10例正常卵巢組織中Hpa蛋白的表達(dá)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用x2檢驗(yàn)、方差分析和t檢驗(yàn)。 二、結(jié)果 1.HpamRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，棕黃色的陽性顆粒主要在癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)。 2.正常卵巢組織中Hpa蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中表達(dá)。卵巢癌組織

6、中Hpa蛋白主要表達(dá)在癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)，在癌巢周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞偶有表達(dá)。 3.41例卵巢癌中Hpa蛋白陽性33例，陰性8例，陽性率為80.48％。在10例正常卵巢組織中1例呈陽性表達(dá)，陽性率為10.00％。Hpa在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05)。 4.晚期卵巢癌(Ⅲ-Ⅳ期)中Hpa蛋白表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度高于早期卵巢癌(Ⅰ-Ⅱ期)(P＜0.01)；低分化組中Hpa蛋白表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度高于高-中分化組

7、(P＜0.05)；不同組織學(xué)類型及年齡組中Hpa蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。 三、討論 Hpa是人體內(nèi)唯一能夠降解HSPG的內(nèi)切酶，在腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等過程中起著極其重要的作用，是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。在人類多種惡性腫瘤中均可檢測到Hpa的表達(dá)，但其表達(dá)率可能有所不同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HpamRNA與Hpa蛋白的表達(dá)具有一致性，棕黃色的陽性顆粒主要在癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)；正常卵巢組織中H

8、pa蛋白陽性率為10.00％，卵巢癌中Hpa蛋白表達(dá)陽性率為80.48％，Hpa在卵巢癌組織中的表達(dá)高于正常卵巢；本實(shí)驗(yàn)結(jié)合臨床病理參數(shù)對Hpa蛋白在卵巢癌中的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)晚期以及低分化的卵巢癌中Hpa蛋白表達(dá)率及強(qiáng)度分別高于早期和高-中分化的卵巢癌，提示Hpa在促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。 第二部分：乙酰肝素酶與卵巢癌血管生成的關(guān)系 一、材料與方法 1.標(biāo)本來源：同第一部分。 2.實(shí)

9、驗(yàn)指標(biāo)及方法： 2.1.采用免疫組化S-P法，CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)MVD。 2.2.采用免疫組化S-P法，檢測卵巢癌中bFGF蛋白的表達(dá)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用t檢驗(yàn)、方差分析和相關(guān)性分析。 二、結(jié)果 1.CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，著色位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒。41例卵巢癌組織中MVD計(jì)數(shù)11～236，平均值為65.20±63.59。 2.卵巢癌組織中Hpa蛋白的表

10、達(dá)與MVD成正相關(guān)r=0.351(P＜0.05)。 3.晚期和低分化癌組中的MVD值分別高于早期和高-中分化癌組(P＜0.05)。 4.卵巢癌組織中bFGF陽性28例(28/41)，bFGF陽性部位主要在腫瘤細(xì)胞胞漿中，bFGF陽性表達(dá)組MVD值高于bFGF陰性表達(dá)組MVD值(77.01±67.43vs39.76±47.17)(P＜0.05)。 5.卵巢癌組織中Hpa表達(dá)和bFGF表達(dá)呈正相關(guān)r=0.420(P＜

11、0.05)。 6.41例卵巢癌組織中Hpa、bFGF共陽性表達(dá)25例。共陽性表達(dá)組的MVD值高于其他組的MVD值(82.05±69.43vs38.87±43.10)(P＜0.05)。 三、討論 惡性腫瘤的無限制侵襲性生長及其轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，目前研究表明Hpa的高表達(dá)可以明顯促進(jìn)腫瘤組織的血管生成能力，并且認(rèn)為Hpa通過直接、間接兩種方式發(fā)揮促血管生成作用：①直接作用，Hpa可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞以生芽方式促進(jìn)血

12、管生成；②間接作用，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放HS-bFGF復(fù)合物和產(chǎn)生HS降解片段以促進(jìn)bFGF活性來間接誘發(fā)血管生成反應(yīng)。我們的研究結(jié)果顯示：33例Hpa蛋白表達(dá)陽性的卵巢癌病例中Hpa與MVD成正相關(guān)，表明Hpa在卵巢癌中的表達(dá)增高，能夠促進(jìn)卵巢癌的血管生成能力；Hpa表達(dá)和bFGF表達(dá)呈正相關(guān)，Hpa、bFGF二者均陽性表達(dá)組的MVD值高于其他組的MVD值，表明Hpa有可能通過釋放和激活bFGF來促進(jìn)卵巢癌的血管生成，且二者對腫瘤的血

13、管生成起著協(xié)同的作用。 第三部分：乙酰肝素酶與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系 一、材料與方法 1.標(biāo)本來源：同第一部分。 2.實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及方法： 2.1.免疫組化檢測，方法及結(jié)果同第一、二部分。 2.2.臨床隨訪。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用Kaplan-Meier法，log-rank法。 二、結(jié)果 收集病例41例均經(jīng)電話隨訪，其中4例失訪。年齡29-73歲，平均50±10歲。隨訪時(shí)間截

14、止到2005年12月，平均生存時(shí)間為389.73±218.11天，最長隨訪時(shí)間為1081天，最短90天。采用Kaplan-Meier法計(jì)算平均生存時(shí)間，Hpa表達(dá)陽性組的平均生存時(shí)間為583.97±77.19天，Hpa表達(dá)陰性組為682.33±100.97天，二者比較無顯著性差異(P=0.171)。 三、討論 在人類多種惡性腫瘤中均可檢測到Hpa的表達(dá)，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hpa是膀胱癌、胰腺癌和胃癌的重要預(yù)后因素，Hpa是否可

15、以作為卵巢癌的獨(dú)立預(yù)后因素呢?我們對41例卵巢癌病例進(jìn)行了隨訪(其中4例失訪)，Kaplan-Meier法計(jì)算平均生存時(shí)間，Hpa表達(dá)陽性組的平均生存時(shí)間為583.97±77.19天，Hpa表達(dá)陰性組為682.33±100.97天，二者比較無顯著性差異，該結(jié)果可能與研究例數(shù)少，隨訪時(shí)間短有關(guān)系。從Kaplan-Meier生存曲線可以看到隨著隨訪時(shí)間的延長Hpa表達(dá)陽性組的生存曲線較Hpa表達(dá)陰性組有更明顯的下降趨勢，如果增加樣本量、延長

16、隨訪時(shí)間，有可能發(fā)現(xiàn)Hpa表達(dá)陽性組的生存時(shí)間低于：Hpa表達(dá)陰性組。 結(jié)論： 1.采用原位雜交及免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Hpa在卵巢癌中表達(dá)增高，晚期以及低分化的卵巢癌中的Hpa蛋白陽性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度分別高于早期和高-中分化的卵巢癌組織，提示Hpa在促進(jìn)腫瘤穿透細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。 2.卵巢癌病例中Hpa蛋白的表達(dá)與MVD成正相關(guān)；Hpa表達(dá)和bFGF表達(dá)呈正相關(guān)；Hpa、b