β-酪啡肽-7的制備及其防治酒精性脂肪肝的研究.pdf

1、1.β-酪啡肽-7的制備(分離、純化與鑒定) 目的:探討酪蛋白酶解產(chǎn)生β-酪啡肽-7(β-CM-7)的最適條件；建立酶解產(chǎn)物的分離及其鑒定β-CM-7的方法。 方法:將酪蛋白酶解，其酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜過濾，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法分析其酶解情況。用反相高效液相色譜層析(RP-HPLC)，C18柱，以-βCM-7為標準已知樣，利用保留時間外標法和內(nèi)標法，鑒定酪蛋白酶解產(chǎn)物中的β-CM-7。

2、酶解上清液經(jīng)Sephadex G-15凝膠層析分離，得到不同組分，然后用RP-HPLC定性和定量鑒定各組分中的β-CM-7。把經(jīng)過Sephadex G-15凝膠層析分離得到的粗提液進行DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，得到不同組分，然后用RP-HPLC定性和定量鑒定各組分中的β-CM-7。 結果:酪蛋白在胃蛋白酶作用下水解120分鐘，產(chǎn)生β-CM-7量最多。酶解產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-15凝膠

3、層析后，酶解產(chǎn)物中小分子物質(zhì)被分開，經(jīng)RP-HPLC檢測，Sephadex G-15洗脫液的第6組分中含有β-CM-7,其含量為20.5μg.mL-1。DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析進一步提純Sephadex G-15的第6組分，經(jīng)RP-HPLC檢測，DEAE-Sepharose Fast FIow洗脫液的第3組分中含有β-CM-7，其含量為29.51μg.mL-1.　　結論:酪蛋白經(jīng)過胃蛋白酶酶解后可

4、以生成13-CM-7。通過Sephadex G-15凝膠層析和通過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析可提純β-CM-7。通過RP-HPLC的方法可以對β-CM-7加以定性和定量鑒定。 2.β-酪啡肽-7對小鼠酒精性脂肪肝的防治作用及機制研究 目的:建立小鼠酒精性脂肪肝(AFL)模型。探討β-酪啡肽-7(β-CM-7)對AFL的防治作用及其部分作用機制。 方法:采用胰蛋白酶消化、分離乳

5、鼠肝細胞進行原代培養(yǎng)，乙醇體外誘導肝細胞損傷，以不同濃度的β-CM-7對肝細胞保護，MTT比色法檢測肝細胞存活率。通過酒精灌胃的方法建立小鼠酒精性脂肪肝模型。昆明種雄性小M60R，隨機分為6組：對照組、模型組、護肝片組β-CM-7 Ⅰ組、B-CM-7 Ⅱ組和β-CM-7 Ⅲ組。除正常組外，其余各組采用酒精溶液灌胃，酒精用量分別為30％、10 mg.kg-1、40％、11 mg.kg-1、50％和12mg.kg-1，四周為一階段，每日分兩

6、次灌胃至第12周末，誘導產(chǎn)生小鼠AFL模型。對照組灌胃等量牛理鹽水。造模的同時給予藥物干預，護肝片組給予護肝片(0.3g.kg-1)。β-CM-7 Ⅰ組灌胃β-CM-7(2.0×10g.L-1)，β-CM-7Ⅱ組灌胃β-CM-7(2.0×10-2g.L-1)，β-CM-7Ⅱ組灌胃β-CM-7(2.0× 10g.L-1)，每次250μl。整個實驗周期共12周。實驗結束時，處死小鼠，收集血清和肝臟。測定體重，肝重，計算肝/體重比值，即為肝臟

7、指數(shù)。測定小鼠血清肝功能酶ALT和AST及血脂TG、TC、LDL-C和HDL-C的變化。取小鼠肝組織制備肝勻漿，試劑盒測定肝組織中SOD、GSH-PX活力及MDA含量。取小鼠肝組織作病理切片，HE及油紅O染色，行病理學觀察。 結果:β-CM-7對乙醇引起的小鼠原代培養(yǎng)肝細胞的損傷有保護作用。在動物模型實驗中，模型組小鼠肝指數(shù)顯著增高，血清ALT和AST的活性，TG、TC及LDL-C含量均明顯增高，HDL-C含量明顯降低。組織病

8、理學檢查提示，模型組小鼠肝臟出現(xiàn)廣泛的細胞內(nèi)小泡性脂肪變性。β-CM-7 Ⅰ組能降低小鼠肝臟指數(shù)，β-CM-7 Ⅰ組肝指數(shù)較模型組顯著降低(P<0.05)。顯示β-CM-7具有保護肝細胞作用。與模型組相比，β-CM-7 I組ALT和AST含量顯著降低，顯示β-CM-7有促進小鼠肝細胞脂類代謝作用。與模型組相比，β-CM-7 I組能顯著降低小鼠血清TG和LDL-C含量，提高血清HDL-C含量(P<0.01)。β-CM-7 I組與模型組相比