小鼠前額葉HCN通道在orexin A皮層興奮性效應(yīng)中的作用.pdf

1、Orexin(又稱hypocretin)是1998年發(fā)現(xiàn)的一類小分子神經(jīng)肽，主要由外側(cè)下丘腦區(qū)特定神經(jīng)元產(chǎn)生。Orexin系統(tǒng)包括來(lái)源于同一前體分子的兩個(gè)單體orexin A和orexin B，以及兩種特異的G蛋白耦聯(lián)受體OXIR和OX2R。Orexin系統(tǒng)與機(jī)體一系列生理功能的調(diào)控相關(guān)，目前認(rèn)為其最重要的功能是對(duì)睡眠，覺醒的調(diào)節(jié)。前額葉皮層(prefrontalcortex，PFC)是大腦高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)的中樞，其功能的順利執(zhí)行與其覺

2、醒狀態(tài)的維持密切相關(guān)?！俺瑯O化激活.環(huán)核苷酸門控的陽(yáng)離子通道(hyperpolarization- activated cyclicnucleotide-gated channelo HCN channel)”位于前額葉皮層錐體神經(jīng)元的樹突，其開放引發(fā)“超極化激活的電流(hyperpolarization-activated currents，Ih)”。HCN通道參與樹突信息整合過(guò)程，因此在前額葉皮層興奮性的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。目前

3、已知多種神經(jīng)遞質(zhì)和化學(xué)藥物可以通過(guò)其對(duì)HCN通道的調(diào)控來(lái)影響或者改變神經(jīng)元的興奮性。促醒肽orexin A對(duì)前額葉皮層錐體神經(jīng)元具有較強(qiáng)的興奮性效應(yīng)，而HCN通道是否也參與了orexinA這種興奮性效應(yīng)的產(chǎn)生和維持，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)，在課題組前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首先觀察HCN通道對(duì)小鼠前額葉皮層緣前區(qū)(the prelimbic area，PL)V層錐體細(xì)胞興奮性的影響，然后進(jìn)一步研究orexi

4、n A對(duì)Ih電流的影響，分析HCN通道在orexin A細(xì)胞興奮性效應(yīng)中的作用，并對(duì)其相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)機(jī)制作初步的探討。結(jié)果如下： 1.HCN通道參與PL區(qū)V層錐體神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié) 電流鉗模式下，注入一定劑量的內(nèi)向電流，使記錄細(xì)胞產(chǎn)生一定頻率的自發(fā)性放電，給予HCN通道阻斷劑ZD7288灌流給藥后，記錄細(xì)胞的放電頻率明顯加快；相反，給予8-Br-cAMP使厶增大后，記錄細(xì)胞的放電頻率明顯減慢。另外，在靜息電位水平下，ZD

5、7288使固定電流強(qiáng)度刺激下的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)目顯著增多；相反，給予8-Br-cAMP使動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)目顯著減少。上述結(jié)果表明：HCN通道狀態(tài)能夠影響前額葉皮層神經(jīng)元的興奮性，即增強(qiáng)HCN通道活性可以降低神經(jīng)元興奮性，反之，抑制HCN通道活性則可以增加神經(jīng)元興奮性。 2.Orexin A的興奮性效應(yīng)與反應(yīng)細(xì)胞Ih電流的產(chǎn)生具有密切關(guān)系 實(shí)驗(yàn)中，并非所有的PL區(qū)V層錐體神經(jīng)元對(duì)orexin A均有反應(yīng)，反應(yīng)率為51.9％(2

6、8/54)，根據(jù)細(xì)胞能否產(chǎn)生Ih電流，對(duì)反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞作進(jìn)一步的分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ih(+)錐體神經(jīng)元對(duì)orexin A的反應(yīng)率為66.7％(24/36)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Ih(-)錐體神經(jīng)元對(duì)orexinA的反應(yīng)率22.2％(4/18)(P<0.01)，此結(jié)果強(qiáng)烈提示orexinA與Ih電流具有密切關(guān)系。 3.Orexin A對(duì)HCN通道具有抑制作用，該效應(yīng)由OXIR介導(dǎo)，PKC參與 電流鉗模式下，orexin A使反轉(zhuǎn)電位“sa

7、g”明顯減小，其中，“sag ratio”值由1.31±0.07下降到1.02±0.05(P<0.05，n=7)。電壓鉗模式下，orexin A使Ih電流幅值在各個(gè)躍階電壓水平均有減小，-120mv下最明顯。另外，通過(guò)獲得Ih電流激活曲線的“tail”電流圖像，根據(jù)Boltzmann方程計(jì)算出每一電壓水平下的Itail.max-Itail/Itail. max值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：orexin A使Ih電流激活曲線向超極化方向移動(dòng)。上述結(jié)果表明

8、：orexin A對(duì)HCN通道具有抑制作用。 電壓鉗模式下，重復(fù)前面的實(shí)驗(yàn)方式，給予OXIR阻斷劑SB-334867，結(jié)果顯示：給藥前，orexin A使-120mv下的Ih電流下降到51.6±6.7pA；給藥后，Ih電流恢復(fù)到75.4±8.2pA(P<0.05，n=3)，將SB-334867和orexin A沖洗置換后，Ih電流基本恢復(fù)到最大水平；給予PKC抑制劑BIS- II，結(jié)果顯示：給藥前，orexin A使Ih電流下降

9、到原有幅值的52.6±4.8％，給藥60min和90min后，Ih電流分別恢復(fù)到65.4±5.5％(P<0.05，n=7)和83.6±6.7％(P<0.01，n=5)。上述結(jié)果表明：OXIR和PKC參與介導(dǎo)orexinA對(duì)HCN通道的抑制作用。 4.HCN通道的狀態(tài)影響orexin A的細(xì)胞興奮性效應(yīng) 電流鉗模式下，先選擇對(duì)orexin A具有明確興奮性反應(yīng)且具有典型Ih電流的PL區(qū)V層錐體神經(jīng)元，然后給予8-Br-cA

10、MP增強(qiáng)Ih電流，再次觀察orexin A對(duì)記錄細(xì)胞的興奮性效應(yīng)。結(jié)果顯示：給藥后，orexin A的興奮性效應(yīng)有所減弱，動(dòng)作電位發(fā)放頻率由5.83±0.45Hz下降到3.78±0.66Hz(P<0.05，n=4)。此結(jié)果表明HCN通道的狀態(tài)能夠影響orexin A的細(xì)胞興奮性效應(yīng)。 綜上所述，本研究結(jié)果表明：第一，HCN通道參與PL區(qū)V層錐體神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)。第二，orexin A對(duì)HCN通道具有抑制作用，并且該效應(yīng)由OXI