CTGFshRNA治療人翼狀胬肉的實驗研究.pdf

1、[目的]翼狀胬肉是眼科常見病和多發(fā)病，是局部球結(jié)膜及其下纖維血管組織呈三角形膜樣增生而侵犯角膜的一種慢性眼表疾病。翼狀胬肉的治療方法雖多，但治療效果都不甚理想，術(shù)后易復(fù)發(fā)，而且預(yù)防復(fù)發(fā)的輔助治療有較多的毒副作用，因此，有必要尋求更有效、更安全的治療方法。結(jié)締組織生長因子(CTGF)是一種新發(fā)現(xiàn)的促纖維化細(xì)胞因子，是轉(zhuǎn)化生長子β(TGF-β)致纖維化作用的直接下游效應(yīng)介質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)，CTGF與翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。RNA干擾是

2、將雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞引起特異基因mRNA降解的一種反應(yīng)現(xiàn)象，能特異地介導(dǎo)同源基因沉默，抑制同源基因表達(dá)，從而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及其功能。本研究應(yīng)用結(jié)締組織生長因子短發(fā)夾RNA(CTGFshRNA)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染翼狀胬肉成纖維細(xì)胞，研究其對CTGFmRNA和蛋白表達(dá)的影響及其對細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響，為進(jìn)一步探索翼狀胬肉基因治療新方法提供實驗依據(jù)。
　　 [方法]將構(gòu)建成功的CTGFshRNA表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectam

3、in2000以不同的比例轉(zhuǎn)染翼狀胬肉成纖維細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀篩選出轉(zhuǎn)染效率最高時質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例，作為最適比例。實驗分為四組：CTGFshRNA表達(dá)質(zhì)粒組、陰性質(zhì)粒組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑組和空白對照組。按照最適比例轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，24h后應(yīng)用RT-PCR和Real-time qRT-PCR技術(shù)檢測翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中CTGF mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用Western blot檢測翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)水平；應(yīng)用羥脯氨酸檢測法

4、檢測細(xì)胞上清液中膠原含量。從而探討CTGF在翼狀胬肉發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及CTGFshRNA表達(dá)質(zhì)粒對翼狀胬肉的治療作用。
　　 [結(jié)果]質(zhì)粒與脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染比例為1:2.5時，轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)(56.7±1.5)％。各實驗組與空白對照組相比，陰性質(zhì)粒組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑組對CTGF基因表達(dá)及細(xì)胞外膠原含量均無影響，而CTGFshRNA表達(dá)質(zhì)粒組CTGFmRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，細(xì)胞上清液中膠原含量明顯減少