PTSD大鼠海馬和下丘腦5-HT1A受體活性及前額皮質(zhì)ERK變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言
　　 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是指在強(qiáng)烈的精神創(chuàng)傷后發(fā)生的心理、生理的應(yīng)激反應(yīng)所表現(xiàn)出的一系列臨床綜合癥,是應(yīng)激精神疾病中最為典型的一種。其核心癥狀可以簡(jiǎn)述為闖入性再體驗(yàn)、警覺性增高及反應(yīng)麻木。隨著戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力、重大交通事故和自然災(zāi)害等意外事件的逐漸增多,PTSD發(fā)生率也愈加增高?，F(xiàn)今,PTSD以其發(fā)病率高、病程長(zhǎng)、難以治愈等特點(diǎn),嚴(yán)重影響人們身心健康而備受關(guān)

2、注。國內(nèi)外對(duì)PTSD進(jìn)行了大量研究,但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明,HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)是PTSD的神經(jīng)內(nèi)分泌一個(gè)特征。神經(jīng)遞質(zhì)5一羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)及其受體在HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)中起重要作用。5-羥色胺1A受體在情緒和精神調(diào)節(jié)中起重要作用。但其在PTSD中的作用目前研究不一。ERK1/2在包括神經(jīng)元在內(nèi)的許多細(xì)胞中均起重要作用,但目前對(duì)SPS時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)元中ERK分子磷酸化的研究還只是剛剛起

3、步。
　　 單一連續(xù)刺激(single prolonged stress,SPS)是PTSD動(dòng)物模型的理想方法,該方法已經(jīng)被國際所認(rèn)同。本研究采用SPS方法建立PTSD大鼠模型,測(cè)定大鼠行為學(xué)改變和血清皮質(zhì)醇濃度,驗(yàn)證PTSD模型的準(zhǔn)確性。為探討5-HT1A受體對(duì)GR和CRF的影響,我們利用5-HT1A特異性阻斷劑作用于SPS大鼠,觀察大鼠海馬GR和下丘腦CRF的變化。并觀察SPS大鼠mPFC中磷酸化的ERK1/2和c-fos的

4、變化,探討ERK通路抑制劑PD98059的作用。為揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、PTSD大鼠行為學(xué)改變
　　 將Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。采用SPS方法建立PTSD模型。采用曠場(chǎng)(open-field,OF)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮(Morris water mace,MWM)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定,并測(cè)

5、定大鼠的恐懼記憶的行為(僵立行為測(cè)定),采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)大鼠血清皮質(zhì)醇濃度。
　　 2、PTSD大鼠5-HT1A受體活性與海馬GR和下丘腦CRF表達(dá)的關(guān)系
　　 大鼠分為四組:(1)正常對(duì)照組(normal group),大鼠既不給予SPS處理,也不給予藥物干預(yù)；(2)假手術(shù)組(sham group),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不給予SPS處理,但給予等體積的溶劑；(3)模型組(SPS group),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予SPS處理,處理前給予等

6、體積溶劑；(4)阻斷組(blockade group),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予SPS處理和5-HT1A受體拮抗劑WAY100635。膠體金免疫電鏡觀察5-HT1A在海馬和下丘腦神經(jīng)元內(nèi)的分布。免疫組織化學(xué)方法分析海馬GR和下丘腦CRF表達(dá)。Westernblotting分析海馬GR表達(dá)。RT-PCR分析GR mRNA和CRF mRNA變化。
　　 3、PTSD大鼠前額皮質(zhì)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶的變化
　　 大鼠被隨機(jī)分為三組:對(duì)

7、照組、SPS組和PD98059+SPS組。SPS組和PD98059+SPS組大鼠給予SPS,并在SPS前30min分別雙側(cè)注入生理鹽水和PD98059,對(duì)照組大鼠給予等體積生理鹽水。用SABC法進(jìn)行mPFC部位的pERK1/2的免疫組織化學(xué)染色,將染色后的切片經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。Western blotting分析mPFC部位的pERK1/2。RT-PCR分析c-fos mRNA表達(dá)
　　 結(jié)果
　　 一、

8、PTSD大鼠行為學(xué)改變
　　 1、OF實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 兩組大鼠在曠場(chǎng)箱內(nèi)主要在箱壁區(qū)域活動(dòng),其運(yùn)動(dòng)符合嚙齒類動(dòng)物的趨觸性(thigmotaxis)的自然屬性,即嚙齒類動(dòng)物趨向于沿壁活動(dòng)。模型組大鼠中央格停留時(shí)間和直立次數(shù)顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余指標(biāo)兩組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2、EMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 EMP結(jié)果表明,大鼠活動(dòng)符合大鼠趨暗的自然屬性,即大

9、鼠趨向于在光線暗處活動(dòng),大鼠在閉臂內(nèi)活動(dòng)時(shí)間和路程顯著多于開臂。隨著大鼠對(duì)環(huán)境的逐漸適應(yīng),大鼠向開臂內(nèi)的探究行為逐漸增多。模型組大鼠在開臂內(nèi)停留時(shí)間所占總臂內(nèi)停留時(shí)間比顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)占總進(jìn)臂次數(shù)的百分比顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3、MWM實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。<

10、br>　　 4、僵立行為測(cè)定結(jié)果
　　 模型組大鼠再次放入強(qiáng)迫游泳玻璃缸中(重新面臨恐懼情景時(shí))后,大鼠表現(xiàn)為明顯的僵立行為。對(duì)照組大鼠重新面臨恐懼情景時(shí),行為模式與模型組顯然不同,表現(xiàn)為自由運(yùn)動(dòng),出現(xiàn)探究、理毛等行為。對(duì)照組僵立行為百分比顯著低于模型組,兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 5、血清皮質(zhì)酮濃度
　　 模型組大鼠血清皮質(zhì)酮濃度顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

11、　　 二、PTSD大鼠5-HT1A受體活性與海馬GR受體和下丘腦CRF表達(dá)的關(guān)系
　　 1、GR和CRF免疫組化分析結(jié)果
　　 GR的陽性細(xì)胞主要分布于海馬的CA1區(qū)。正常對(duì)照組和假手術(shù)組之間GR表達(dá)沒有明顯差異。與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比較,模型組GR表達(dá)增高,陽性細(xì)胞明顯增多(P<0.01),而阻斷組陽性細(xì)胞數(shù)量則比SPS組減少(P<0.05),但仍高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)。正常對(duì)照組和假手術(shù)組之間

12、下丘腦CRF表達(dá)沒有明顯差異,模型組CRF表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01),而阻斷組陽性細(xì)胞數(shù)量則比SPS組減少(P<0.05)。
　　 2、Western blotting分析海馬GR表達(dá)
　　 正常對(duì)照組和假手術(shù)組均有一定表達(dá),模型組表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01),阻斷組GR表達(dá)低于SPS組(P<0.01)。
　　 3、RT-PCR分析海馬GR mRNA和下丘腦CRF mRN

13、A表達(dá)
　　 正常對(duì)照組和假手術(shù)組GR和CRFmRNA表達(dá)沒有區(qū)別,但模型組二者表達(dá)顯著增高(P<0.01),這種增高可以被WAY100635阻斷(P<0.05)。
　　 三、PTSD大鼠前額皮質(zhì)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶的變化
　　 1、pERK1/2免疫組化染色
　　 pERK1/2蛋白定位在胞漿,陽性細(xì)胞顯示棕黃色。對(duì)照組陽性細(xì)胞的OD值比較小,SPS組大鼠明顯增高(P<0.01),PD98059+S

14、PS組大鼠陽性細(xì)胞OD值明顯比SPS組小(P<0.01)。
　　 2、pERK1/2 Western blotting分析
　　 SPS組大鼠pERK1/2相對(duì)表達(dá)明顯增高(P<0.01),PD98059+SPS組大鼠pERK1/2比SPS組表達(dá)弱(P<0.01)。結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致。
　　 3、RT-PCR分析結(jié)果
　　 正常大鼠c-fos mRNA有低量表達(dá)。SPS大鼠表達(dá)增高,注入PD9805