SSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記對片形吸蟲的分類鑒別研究.pdf

1、片形吸蟲是一種危害牛羊等反芻獸和人類的寄生性蠕蟲，常見的有兩個(gè)種：肝片吸蟲(Fasciola hepatica)和大片吸蟲(Fasciola gigantica)。牛、羊片形吸蟲病呈全球性流行，在全球每年造成約20億美元的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)該病的人畜共患性也給疫區(qū)人民的身體健康帶來嚴(yán)重危害。兩種片形吸蟲在形態(tài)上及其相似，但在蟲體抗原性、免疫原性、對宿主的致病性、對藥物的敏感性等方面均存在差異，所以正確鑒別片形吸蟲的種類，不僅是研究片形吸蟲的

2、基礎(chǔ)及前提，且也對防治片形吸蟲病具有重要意義。長期以來，片形吸蟲的分類鑒定主要依據(jù)成蟲的形態(tài)、生活史、流行病學(xué)等特征來進(jìn)行，這在分類學(xué)的發(fā)展上曾經(jīng)起了重要的作用。但由于片形吸蟲種內(nèi)個(gè)體差異較大，同一蟲種又因宿主種類、宿主反應(yīng)的不同而異，導(dǎo)致蟲體的形態(tài)不規(guī)則。鑒于傳統(tǒng)分類方法的局限性，研究人員不得不另辟途徑。隨著細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們開始從細(xì)胞、分子水平探討片形吸蟲的遺傳變異及分類，其中分子遺傳學(xué)分類方法是近年來的研究熱點(diǎn)。雖然

3、研究者建立了多種分類方法，但得到的結(jié)果卻存在一定差異，所以人們不得不轉(zhuǎn)向其它的分類方法。SSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記是近年來發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記。SSR由丁種類多、分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性高、重組率低、按孟德爾共顯性方式遺傳等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于寄生蟲蟲種的鑒別和分類學(xué)的研究。SCAR標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，這兩種標(biāo)記為片形吸蟲的分類提供了思路。 本課題從重慶、

4、四川、廣兩采集不同宿主片形吸蟲成蟲樣本，并用SSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記對其進(jìn)行研究。一、用SSR標(biāo)記進(jìn)行研究：提取片形吸蟲DNA，利用網(wǎng)上搜尋的SSR引物對其進(jìn)行擴(kuò)增，PAGE電泳，根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行片形吸蟲的遺傳多樣性分析和聚類分析；二、用SCAR標(biāo)記進(jìn)行研究：提取片形吸蟲DNA，利用6種ISSR引物對其進(jìn)行擴(kuò)增，從中尋找片形吸蟲的特異片斷，并回收克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果重新設(shè)計(jì)SCAR引物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使其能有效區(qū)分不同種的片形吸蟲。獲得的主

5、要結(jié)果如下： 1.網(wǎng)站http://bioinformatics．Pbcbasc.latrobe．edu．a(chǎn)u/cgi-bin/ssr提供各種物種的EST-SSR序列及其引物，從中搜索片形吸蟲的SSR序列，得到4條，由于數(shù)量太少，所以我們同時(shí)搜索了近源種日本血吸蟲和曼氏血吸蟲SSR序列，分別得到了6183條和8133條序列。通過設(shè)定篩選條件，共篩選了17對SSR引物，其中片形吸蟲SSR引物4對，日本血吸蟲SSR引物6對，曼氏血吸

6、蟲SSR引物7對。用這17對SSR引物對8個(gè)來自重慶、四川和廣西的不同宿主的片形吸蟲樣本進(jìn)行擴(kuò)增，PAGE電泳，結(jié)果顯示有13對SSR引物能夠進(jìn)行有效擴(kuò)增。13對SSR引物總共檢測到了79個(gè)等位基因，每對SSR引物能檢測到4-10個(gè)，平均為6.2個(gè)，反映了片形吸蟲的遺傳多態(tài)性較高。 2.根據(jù)SSR條帶，構(gòu)建0，1矩陣，并用NTSYS-pc軟件計(jì)算8個(gè)片形吸蟲樣本之間的遺傳相似系數(shù)。結(jié)果表明，片形吸蟲種間差異為0.425-0.5

7、，肝片吸蟲種內(nèi)差異為0.2-0.4，兩株大片吸蟲種內(nèi)差異為0.3625，說明片形吸蟲種間差異大于種內(nèi)差異，種內(nèi)變異也比較明顯。 3.根據(jù)相似系數(shù)用NTSYS-pc軟件對本研究的8個(gè)片形吸蟲樣本進(jìn)行聚類，8個(gè)樣本被聚為兩類，第一類為大片吸蟲，包括廣西水牛源樣本和重慶水牛源暫定種樣本，第二類為肝片吸蟲，包括重慶奶牛源、黃牛源、水牛源和黃羊源樣本以及四川牦牛源樣本。第二類又可以分為兩個(gè)亞類，第一亞類為四川牦牛源樣本，第二亞類包括除重慶

8、水牛源暫定種樣本外其他采自重慶不同宿主的片形吸蟲樣本。初步說明SSR標(biāo)記不僅能夠區(qū)分大片吸蟲和肝片吸蟲，還能夠區(qū)分出片形吸蟲的不同地理株。 4.用6種ISSR引物對來源重慶、四川以及廣西的片形吸蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物(GACA)4和引物(AG)8能夠擴(kuò)增出特異片斷，其中引物(GACA)4能在肝片吸蟲中擴(kuò)增出兩條900bp左右的特異片斷，命名為ISSRF．h1和ISSRF．h2，能在大片吸蟲中擴(kuò)增出一條約900bp的特異片

9、斷，命名為ISSRF．g；引物(AG)8能夠在肝片吸蟲中擴(kuò)增出一條300-400bp的特異片斷，命名為ISSRF．h3。將這些片斷回收克隆測序，序列結(jié)果顯示，ISSRF．h1片斷長919bp，ISSRF．h2片斷長806bp，ISSRF．h3片斷長364bp，ISSRF．g片斷長845bp。 5.根據(jù)測序結(jié)果，在片斷兩端包括ISSR引物再延伸4-7bp設(shè)計(jì)了4對SCAR引物，其中3對肝片吸蟲SCAR引物，命名為SCARF．h1、

10、SCARF．h2、SCARF．h3，1對大片吸蟲SCAR引物，命名為SCARF．g。以所采集的樣本進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，3對肝片吸蟲SCAR引物均能在肝片吸蟲中產(chǎn)生一條特異條帶，在大片吸蟲中均沒有擴(kuò)增；1對大片吸蟲SCAR引物能在大片吸蟲中產(chǎn)生一條特異條帶，在肝片吸蟲無擴(kuò)增。表明4個(gè)SCAR標(biāo)記均轉(zhuǎn)化成功，它們能有效區(qū)分不同種的片形吸蟲。 6.從重慶地區(qū)的水牛體內(nèi)采集到一株片形吸蟲，它具有不典型形態(tài)，體長>3cm，長寬比>3，