MAPC-EPC性組織工程化靜脈瓣.pdf

1、采用生物學(xué)及工程學(xué)原理構(gòu)建組織工程化靜脈瓣有望能治愈下肢慢性靜脈功能不全,具有良好的臨床應(yīng)用前景。本文將受體Beagle犬骨髓來(lái)源的成體多能祖細(xì)胞(multipotent adult progenitor cells,MAPC)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPC)作為種子細(xì)胞,采用同種異體脫細(xì)胞靜脈瓣細(xì)胞外基質(zhì)材料作為支架,利用多點(diǎn)注射、加壓灌注的方法將MAPC種植到支架內(nèi)部,然后應(yīng)用血管自動(dòng)

2、旋轉(zhuǎn)脈動(dòng)系統(tǒng),使EPC黏附于支架的內(nèi)表面及瓣膜的竇腔兩面,即得到"MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣”；并對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)特性做了進(jìn)一步研究。然后采用端端吻合術(shù)將構(gòu)建的組織工程化靜脈瓣吻接到受體犬頸外靜脈,觀察其體內(nèi)過(guò)程。本文包括五部分內(nèi)容:MAPC的分離、培養(yǎng)及鑒定；EPC的分離、培養(yǎng)及鑒定；同種異體脫細(xì)胞靜脈瓣支架的制備；MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣體外構(gòu)建；組織工程化靜脈瓣的在體研究。 針對(duì)這些問(wèn)題,本項(xiàng)目采用

3、同種異體脫細(xì)胞Beagle犬靜脈瓣作為支架,聯(lián)合應(yīng)用多點(diǎn)注射、加壓灌注等技術(shù),分別種植成體多能祖細(xì)胞(Multipotent adult progenitorcells,MAPC)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPC),體外構(gòu)建組織工程化靜脈瓣,稱之為"MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣”；并將其吻接于受體Beagle犬頸外靜脈,觀察在體情況,同時(shí)進(jìn)行效用性研究,以研制一種應(yīng)用于治療慢性靜脈功能

4、不全的組織工程化靜脈瓣。 第一部分 MAPC的分離、培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化研究 目的：探討成體犬骨髓MAPC的體外培養(yǎng)條件、生物學(xué)特性及其向平滑肌樣細(xì)胞分化的可能性。 研究方法：無(wú)菌條件下抽取受體Beagle犬髂骨骨髓10ml,采用MAPC特異的擴(kuò)增培養(yǎng)基體外培養(yǎng)全部骨髓。細(xì)胞傳代至第4代,對(duì)所有貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫微珠分選,采用CD45抗體,收集CD45-細(xì)胞即MAPC另瓶培養(yǎng)(MAPC特異擴(kuò)增培養(yǎng)基)。于不同時(shí)

5、間觀察MAPC的形態(tài)、生長(zhǎng)情況,檢測(cè)其表面標(biāo)志；利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)MAPC的生長(zhǎng)周期及特異表面標(biāo)志表達(dá)率；并以分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),采用RT-PCR方法檢測(cè)MAPC OCT-4基因及分化細(xì)胞SM-MHC(smooth muscle cells-myosin heavy chain)基因表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)平滑肌細(xì)胞表面標(biāo)志在分化細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果：光鏡下觀察犬骨髓MAPC體積偏大,長(zhǎng)多角型,數(shù)個(gè)細(xì)長(zhǎng)偽足,細(xì)胞核大,細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞增殖

6、能力旺盛；表達(dá)表面標(biāo)志CDl3和SSEA-1,不表達(dá)CD44、CD45、CD133和MHCII;RT PCR結(jié)果顯示MAPC表達(dá)OCT-4。誘導(dǎo)分化后,分化細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞表面標(biāo)志--α-SMA、calponin、SM-MHC;RT PCR結(jié)果顯示分化細(xì)胞表達(dá)SM-MHC。 結(jié)論:MAPC增殖擴(kuò)增能力強(qiáng)、生物特性穩(wěn)定、易于向平滑肌樣細(xì)胞分化,是心血管組織工程和干細(xì)胞移植較為理想的種子細(xì)胞。 第二部分 EPC的分離、培養(yǎng)

7、、鑒定及誘導(dǎo)分化研究 目的：探討成體犬骨髓EPC的體外培養(yǎng)條件、生物學(xué)特性及其向內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells,EC)分化的能力。 研究方法：無(wú)菌條件下抽取受體Beagle犬髂骨骨髓10ml,采用EGM-MV2培養(yǎng)基體外培養(yǎng)全部骨髓。細(xì)胞傳代至第4代,對(duì)所有貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫微珠分選,采用CD14抗體,收集CD14+細(xì)胞即EPC另瓶培養(yǎng)(EGM-MV2培養(yǎng)基)。于不同時(shí)間觀察EPC的形態(tài)、生長(zhǎng)情況,檢測(cè)其

8、表面標(biāo)志；利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)EPC的生長(zhǎng)周期及特異表面標(biāo)志表達(dá)率；將生長(zhǎng)至18代的貼壁細(xì)胞以分化培養(yǎng)基(M199+20％胎牛血清+VEGF)誘導(dǎo)培養(yǎng)；采用RT-PCR方法檢測(cè)EPC和分化細(xì)胞eNOS、KDR和VE-cadherin基因表達(dá)。同時(shí)采用免疫熒光檢測(cè)分化細(xì)胞內(nèi)皮表面標(biāo)志的表達(dá)。 結(jié)果：早期EPC為分選后8代之前的EPC,體積略小,類圓形,60％融合時(shí)呈串珠樣排列,表達(dá)CD133、CD14;晚期EPC由表達(dá)VE-cad

9、herin、KDR、CD14的早期EPC分化而來(lái),形態(tài)為多邊形,分泌活動(dòng)明顯加強(qiáng),表達(dá)CD133、VE-cadherin、CD14和KDR;誘導(dǎo)分化細(xì)胞呈鵝卵石樣外觀,表達(dá)VⅢ因子、CD31。 結(jié)論：骨髓EPC隨培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)不同生物學(xué)特性,早期EPC不穩(wěn)定,晚期EPC生物學(xué)特性穩(wěn)定、增殖能力強(qiáng)、分化為EC的比率高,是血管組織工程學(xué)研究良好的種子細(xì)胞。 第三部分 同種異體脫細(xì)胞靜脈瓣支架的制備研究 目的：希望找到一

10、種較為理想的制備脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)材料的方法,獲得較為理想的同種異體脫細(xì)胞靜脈瓣支架,為體外構(gòu)建組織工程化靜脈瓣提供支架材料,并探討相應(yīng)的技術(shù)方法。 研究方法：取正常成年Beagle犬(雌雄不限)股靜脈40條,修剪為2 cm左右的段,確保每段保留一對(duì)靜脈瓣,首先采用0.5％Triton X-100+0.05％NH4OH振搖(4℃)處理3天,然后超純水振搖(4℃)漂洗3天,再換用DNase+RNase(37℃)作用12 h,超純水漂

11、洗2 h,完全去除股靜脈壁及瓣膜中的細(xì)胞成分,將得到的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)材料置Eppendorf管中,封口膜密封,60CO輻照滅菌,-80℃保存,即得到同種異體脫細(xì)胞靜脈瓣支架。部分支架進(jìn)行組織學(xué)、形態(tài)學(xué)及力學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果：大體觀察見(jiàn)脫細(xì)胞靜脈瓣支架外形完整,乳白色,H-E染色未見(jiàn)到細(xì)胞成分,纖維連續(xù)無(wú)斷裂。HLA-1免疫組化染色為陰性,說(shuō)明免疫原性極弱。掃描電鏡顯示支架孔隙大小不均,未見(jiàn)到細(xì)胞,膠原纖維排列整齊、連續(xù),未見(jiàn)斷裂。

12、力學(xué)檢測(cè)顯示最大斷裂強(qiáng)度與正常靜脈瓣相比無(wú)明顯差異。 結(jié)論：脫細(xì)胞靜脈瓣支架形態(tài)特征、力學(xué)特性符合生物支架的條件,無(wú)免疫原性,可以作為構(gòu)建組織工程化靜脈瓣的支架材料。 第四部分 MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣的構(gòu)建研究 目的：構(gòu)建MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣,從細(xì)胞與支架的復(fù)合程度、細(xì)胞在支架中的生長(zhǎng)狀態(tài)及機(jī)械性能等方面評(píng)價(jià)其性能。 研究方法：免疫微珠體外分離得到的犬骨髓MAPC和EPC作為種子

13、細(xì)胞,同種異體脫細(xì)胞帶瓣靜脈作為支架,采用多點(diǎn)注射和加壓灌注將受體犬MAPC和EPC種植到同種異體脫細(xì)胞靜脈瓣支架壁內(nèi)、靜脈壁內(nèi)表面及瓣膜竇腔兩面,體外培養(yǎng)2周；取出復(fù)合培養(yǎng)物,制作石蠟切片,H-E染色及膠原纖維、彈性纖維染色檢測(cè)；掃描電鏡檢測(cè)其表面內(nèi)皮化程度；透射電鏡檢測(cè)內(nèi)部MAPC生長(zhǎng)情況；機(jī)械力學(xué)檢測(cè)構(gòu)建靜脈瓣的彈性回復(fù)率及最大斷裂強(qiáng)度。 結(jié)果：體外復(fù)合培養(yǎng)2周后,H-E染色見(jiàn)MAPC能夠生長(zhǎng)至支架內(nèi)部,連成片,分布較均勻

14、,分泌細(xì)胞外基質(zhì)；掃描電鏡檢測(cè)EPC完整覆蓋支架內(nèi)表面,靜脈瓣竇腔兩面均完成了內(nèi)皮化；透射電鏡結(jié)果顯示MAPC長(zhǎng)入支架壁內(nèi)部,生長(zhǎng)狀況良好. 結(jié)論：體外構(gòu)建的MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣,結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性與正常瓣膜相似,種子細(xì)胞在其內(nèi)部生長(zhǎng)均勻,表面再內(nèi)皮化完全,可以作為靜脈瓣移植物進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。 第五部分 MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣的體內(nèi)研究研究 目的：觀察MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣植入受體

15、犬體內(nèi)后,功能發(fā)揮和形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。 研究方法：雌性1 y齡Beagle犬12只,分3組,每組4只。將構(gòu)建的MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣以端端吻合術(shù)吻接至受體犬左側(cè)頸外靜脈。右側(cè)作為對(duì)照組,植入同種異體脫細(xì)胞靜脈瓣支架。術(shù)后1、3、6個(gè)月彩色超聲多普勒檢查,小動(dòng)物超聲檢查及數(shù)字減影血管造影(DSA)后處死實(shí)驗(yàn)犬,取出移植物,大體觀察后,4％多聚甲醛固定,脫水、透明、石蠟包埋,制備石蠟切片,進(jìn)行H-E染色及免疫組織化學(xué)染色。

16、 結(jié)果:MAPC/EPC性組織工程化靜脈瓣植入體內(nèi)后活體檢查：術(shù)后彩色超聲多普勒檢查顯示通暢率實(shí)驗(yàn)組(對(duì)照組)分別為1個(gè)月4/4(4/4),3個(gè)月4/4(2/4),6個(gè)月4/4(1/4);術(shù)后3個(gè)月DSA檢查實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)返流,對(duì)照組可見(jiàn)明顯返流；術(shù)后6個(gè)月小動(dòng)物超聲檢查實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)瓣膜回聲,但是瓣膜運(yùn)動(dòng)受限,對(duì)照組靜脈壁增厚,瓣膜形態(tài)分辨不清。大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察：術(shù)后1個(gè)月實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)血栓形成,靜脈壁及瓣膜壁無(wú)明顯增厚,形

17、態(tài)與正常相似,內(nèi)皮處及瓣膜CD106陽(yáng)性,中膜α-actin及Desmin陽(yáng)性；對(duì)照組出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)血栓,H-E染色為瓣膜處較大附壁血栓,內(nèi)膜除表達(dá)CD106外,α-actin及Desmin也明顯表達(dá)；術(shù)后3個(gè)月實(shí)驗(yàn)組瓣膜處見(jiàn)附壁血栓,但是靜脈壁無(wú)明顯增厚,瓣膜形態(tài)清晰可辨,內(nèi)膜CD106陽(yáng)性,中膜α-actin及Desmin陽(yáng)性；對(duì)照組瓣膜明顯增厚似靜脈壁,不能分清靜脈壁三層結(jié)構(gòu),內(nèi)膜處、瓣膜及靜脈壁均表達(dá)α-actin和Desmin,