西瓜ClMYB46基因的耐低溫功能鑒定及調(diào)控作用分析.pdf

1、西瓜（Citrullus lanatus）是重要的葫蘆科作物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。西瓜是典型的喜溫作物，在早春和反季節(jié)設(shè)施栽培過(guò)程中，常受到低溫脅迫而影響產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。低溫已成為西瓜生產(chǎn)中主要的非生物限制因子，嚴(yán)重制約西瓜的周年供應(yīng)和種植效益提高。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答外界脅迫環(huán)境中起著重要作用，參與調(diào)控下游多個(gè)基因的表達(dá)。本課題前期研究中，通過(guò)挖掘低溫脅迫下西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因參與低溫逆境響應(yīng)。進(jìn)一步分析得出，Cla0056

2、22的表達(dá)量顯著上調(diào)，且屬于MYB-related型轉(zhuǎn)錄因子，但其耐低溫功能及相關(guān)調(diào)控作用尚未明確。為回答上述問(wèn)題，本研究擬采用如下方法解決:對(duì)MYB-related家族成員鑒定、分析Cla005622的結(jié)構(gòu)特征、qRT-PCR鑒定Cla005622對(duì)西瓜低溫脅迫的應(yīng)答、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄活性鑒定Cla005622的特征、超量表達(dá)與煙草遺傳轉(zhuǎn)化后鑒定耐低溫性功能驗(yàn)證、酵母雙雜交探究蛋白互作及功能分析，旨在明確Cla005622對(duì)西瓜低溫逆

3、境的耐低溫功能鑒定及調(diào)控作用，結(jié)果不僅可以解析西瓜的低溫耐受性機(jī)制，同時(shí)還可為后續(xù)從分子育種角度改善西瓜低溫抗性、提高西瓜產(chǎn)量與質(zhì)量提供豐富的基因資源。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.Cla005622基因結(jié)構(gòu)分析及西瓜MYB-related家族基因成員鑒定。使用NCBI預(yù)測(cè)Cla005622蛋白保守結(jié)構(gòu)域得知，其屬于典型的MYB-related基因。為進(jìn)一步探索其在MYB-related家族基因中的特征，通過(guò)HMM算法在西瓜全

4、基因組上共鑒定出50個(gè)MYB-related家族基因，編碼序列長(zhǎng)度240bp-4986bp，等電點(diǎn)4.8-9.97，分子量5890.67-181178.4。據(jù)基因在染色體上的分布順序命名為ClMYB1-ClMYB50。Cla005622對(duì)應(yīng)基因?yàn)镃lMYB46，編碼序列全長(zhǎng)1040bp，編碼334個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.70，分子量為35890.61，位于第10號(hào)染色體。
　　2.ClMYB46對(duì)西瓜低溫逆境的應(yīng)答。以西瓜97103

5、為實(shí)驗(yàn)材料，用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)10℃低溫處理西瓜葉片后6h、12h、24h、48h的基因表達(dá)量變化，變化趨勢(shì)呈現(xiàn)先升高后降低再升高的過(guò)程。其中，6h點(diǎn)的表達(dá)量達(dá)到最高。因此，ClMYB46受低溫脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)。
　　3.ClMYB46的特征分析。亞細(xì)胞定位以本氏煙草為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建載體GV3101[pH7LIC5.0-N-eGFP-ClMYB46]后瞬時(shí)表達(dá)，觀測(cè)熒光信號(hào)位于細(xì)胞核。轉(zhuǎn)錄活性鑒定通過(guò)構(gòu)建Y2HGold[

6、pGBKT7-ClMYB46]，激活HIS3、ADE2報(bào)告基因表達(dá)，具有轉(zhuǎn)錄活性。因此，ClMYB46表達(dá)部位在細(xì)胞核，且具有轉(zhuǎn)錄活性。
　　4.ClMYB46的耐低溫性功能鑒定。以野生栽培煙草為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建載體LBA4404[pHellsgate8-ClMYB46]后進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，qRT-PCR檢測(cè)ClMYB46表達(dá)量，篩選OE1、OE2株系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以野生型煙草WT、轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE2各75株為實(shí)驗(yàn)材料，4℃低

7、溫處理（光周期16h/8 h，光強(qiáng)100μmol m-2s-1）0h、6h、12h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)觀察并取樣。表型觀察、冷害指數(shù)測(cè)定均得出不同時(shí)間點(diǎn)下野生型株系萎蔫程度均高于轉(zhuǎn)基因株系，過(guò)表達(dá)ClMYB46能提高煙草對(duì)低溫逆境的抗性。使用試劑盒測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)下電導(dǎo)率和丙二醛含量變化得知野生型細(xì)胞膜受損傷更嚴(yán)重，過(guò)表達(dá)ClMYB46能提高煙草對(duì)低溫逆境的抗性。
　　以低溫處理不同時(shí)間點(diǎn)下野生型煙草WT、轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE2

8、為材料，qRT-PCR檢測(cè)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因（rab18、ABI1、ABI2）與冷脅迫相關(guān)基因(DREB轉(zhuǎn)錄因子DREB2A、脯氨酸合成促進(jìn)基因P5CS)的表達(dá)量變化。ClMYB46上調(diào)引起rab18上調(diào)表達(dá)、ABH、ABI2下調(diào)表達(dá)、DREB2A、P5CS上調(diào)表達(dá)。
　　5.ClMYB46互作蛋白篩選及點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。重組構(gòu)建無(wú)毒性的誘餌載體Y2HGold[pGBKT7-ClMYB46]，AbA抑制其自激活后Mating法篩