蛻膜細(xì)胞中孕激素受體及TNF-α、IL-1β、NF-κB改變致自然流產(chǎn)的研究.pdf

1、不明原因自然流產(chǎn)的發(fā)生與細(xì)胞因子、免疫系統(tǒng)、激素及其受體的調(diào)控之間的相互作用越來(lái)越受到重視，這一系列的因素與子宮內(nèi)膜的正常蛻膜化、孕囊的植入和胚胎的正常發(fā)育均有密切的關(guān)系。在正常妊娠中，孕激素是維持妊娠的重要激素，孕激素主要通過(guò)孕激素受體(PR)起作用，蛻膜組織中要有一定的孕激素受體(PR)量才能對(duì)激素產(chǎn)生正常的反應(yīng)。受體數(shù)量減少或功能減退，會(huì)影響相應(yīng)的激素發(fā)揮其生理功能。人們發(fā)現(xiàn)對(duì)習(xí)慣流產(chǎn)病人單用孕激素或絨毛膜促性腺激素治療并未獲得理

2、想的保胎效果，所以在孕激素補(bǔ)足后仍然發(fā)生流產(chǎn)的原因是國(guó)內(nèi)外研究的熱門課題。
　　 炎癥因子是導(dǎo)致流產(chǎn)的重要因素之一，其引起流產(chǎn)的機(jī)制是目前研究的重要方向。已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)許多炎性細(xì)胞因子參與流產(chǎn)、早產(chǎn)、分娩啟動(dòng)等生理或病理過(guò)程，腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、核轉(zhuǎn)因子κB(NF-κB)等是目前研究較多的細(xì)胞因子。
　　 細(xì)菌脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中的重要組成成分，能促進(jìn)TNF-α、IL

3、-1β、NF-κB在細(xì)胞中的表達(dá)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程中可能參與著床前胚胎的發(fā)育、著床、蛻膜化、分娩等多個(gè)生殖環(huán)節(jié)。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在激活NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的同時(shí)會(huì)抑制PR的轉(zhuǎn)錄活性。腫瘤壞死因子-a(TNF-α)則是誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生的強(qiáng)刺激劑。
　　 我們通過(guò)研究自然流產(chǎn)患者的蛻膜細(xì)胞中孕激素受體(PR)和腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1β)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κ

4、B)等的表達(dá)情況，與正常妊娠蛻膜細(xì)胞中比較存在明顯的差異；再進(jìn)行體外培養(yǎng)原代蛻膜細(xì)胞，研究細(xì)菌脂多糖(LPS)作用后的蛻膜細(xì)胞中PR的表達(dá)情況，進(jìn)一步證實(shí)感染導(dǎo)致孕激素受體減少是引起自然流產(chǎn)的主要原因之一。
　　 本研究分為三部分，第一部分，采用RT-PCR方法研究自然流產(chǎn)和正常妊娠蛻膜細(xì)胞中孕激素受體mRNA含量；采用原位雜交免疫組化法研究孕激素受體(PR)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、核轉(zhuǎn)錄因子

5、κB(NF-κB)等在自然流產(chǎn)和正常妊娠蛻膜細(xì)胞中的蛋白表達(dá)差異。第二部分，體外培養(yǎng)原代蛻膜細(xì)胞，建立無(wú)血清細(xì)胞模型；在體外培養(yǎng)的蛻膜細(xì)胞中加入不同濃度脂多糖(LPS)，模擬妊娠革蘭陰性菌感染，從光鏡下和電子顯微鏡下觀察感染后蛻膜細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。第三部分，取不同濃度脂多糖(LPS)作用的蛻膜細(xì)胞，用RT-PCR方法研究PR、TSF-α、IL-1β、NF-κB mRNA表達(dá)差異；同時(shí)提取蛋白質(zhì)，用蛋白印跡法研究PR和N

6、F-κB的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，進(jìn)一步證實(shí)脂多糖可通過(guò)引起炎癥因子的增加而使孕激素受體的表達(dá)下調(diào)，為不明原因自然流產(chǎn)的治療提供新的思路。
　　 第一部分孕激素受體改變?cè)谧匀涣鳟a(chǎn)中的研究。
　　 目的：
　　 測(cè)定孕激素受體mRNA和孕激素受體及細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白質(zhì)在自然流產(chǎn)和正常妊娠蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　 方法：
　　 收集自然流產(chǎn)組病例30例作為研究組，另有正常早孕人

7、工流產(chǎn)組病例30例作為對(duì)照組，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RZ-PCR)方法從轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)兩組子宮蛻膜細(xì)胞中的PR mRNA含量差異。
　　 應(yīng)用原位雜交免疫組化方法檢測(cè)PR、TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白質(zhì)在兩組蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)差異，分析PR與TNF-α、IL-1β、NF-κB之間的相互關(guān)系，研究PR對(duì)妊娠的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.研究組蛻膜細(xì)胞中PR mRNA含量比對(duì)照組明顯減少(P<0.05)

8、。2.研究組蛻膜細(xì)胞的PR免疫組化染色陽(yáng)性標(biāo)本百分率低于對(duì)照組，兩組間百分率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但兩組間平均染色分值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；3.研究組蛻膜細(xì)胞中 TNF-α、IL-1β和NF-κB免疫組化染色陽(yáng)性百分率均高于對(duì)照組，兩組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；4.PR的表達(dá)與NF-κB的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，(r=-0.628，P<0.05)，NF-κB的表達(dá)與 TNF-α、IL-1β的表達(dá)呈正相關(guān)(P<

9、0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.與正常妊娠相比較，自然流產(chǎn)蛻膜細(xì)胞中PR mRNA表達(dá)減少。
　　 2.與正常妊娠相比較，自然流產(chǎn)蛻膜細(xì)胞中PR蛋白表達(dá)減少；
　　 3.自然流產(chǎn)蛻膜細(xì)胞中TNF-α、IL-1β與NF-κB蛋白表達(dá)增加；
　　 4.自然流產(chǎn)蛻膜NF-κB的蛋白表達(dá)與PR的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 第二部分脂多糖對(duì)體外培養(yǎng)蛻膜細(xì)胞損傷的研究。
　　 目的：

10、>　　 培養(yǎng)原代人蛻膜細(xì)胞，建立體外人蛻膜細(xì)胞模型，加入不同濃度的脂多糖(LPS)，模擬妊娠期革蘭陰性細(xì)菌感染，研究脂多糖對(duì)體外培養(yǎng)蛻膜細(xì)胞的損傷。
　　 方法：
　　 獲取正常妊娠6～8周的蛻膜組織，采用復(fù)合酶消化法全組分細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞傳代自然增殖法純化蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法和熒光免疫法檢測(cè)細(xì)胞的垂體泌乳素(PRL)表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞特征學(xué)鑒定，建立體外人蛻膜細(xì)胞模型。在此模型上加入不同濃度的LPS，使終濃

11、度分別為25 ng/ml，50 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，培養(yǎng)24h、48h、72h后，應(yīng)用MTT法測(cè)得感染后蛻膜細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，48h后光鏡和電子顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果：
　　 細(xì)胞培養(yǎng)成功，原代培養(yǎng)鏡下可見(jiàn)幾種細(xì)胞成分，絕大部分為單純蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(decidual stromal cell，DSC)，呈梭形或不規(guī)則的星形，核呈卵圓形，大而圓，鏡下形態(tài)一致。PRL免疫細(xì)胞化學(xué)

12、和熒光免疫法證實(shí)90％的培養(yǎng)細(xì)胞呈陽(yáng)性，顯示DSC已經(jīng)得到較高的純化，且其分泌功能仍保持正常。加入不同濃度的LPS后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的抑制率，發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)段下，研究組與對(duì)照組比較，各濃度的LPS對(duì)DSC的抑制率無(wú)明顯影響，P值大于0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而作用48h、72h以后，細(xì)胞的抑制率則有明顯不同，加入高濃度(200 ng/ml)LPS的研究組抑制率為16.88％，明顯高于低濃度(25 ng/ml)LPS的研究組3.96％

13、；在光鏡下，低濃度LPS對(duì)蛻膜細(xì)胞的影響幾乎看不到，高濃度的LPS作用DSC后有輕微改變，而透射電鏡下觀察到對(duì)照組細(xì)胞突觸清晰可見(jiàn)，微絨毛不多，核膜核仁完整，染色質(zhì)分布均勻，研究組可見(jiàn)細(xì)胞體積縮小，表面突起增多，胞漿內(nèi)空泡增多，線粒體水腫等細(xì)胞凋亡改變。而且隨著LPS濃度的增加，細(xì)胞器損傷更明顯，出現(xiàn)細(xì)胞固縮，胞漿水腫或長(zhǎng)滿絨毛，核固縮，核膜破裂、裂解。
　　 結(jié)論：
　　 1.建立體外人蛻膜細(xì)胞模型成功；
　　

14、 2.不同濃度LPS作用于體外培養(yǎng)的蛻膜細(xì)胞48小時(shí)和72小時(shí)，細(xì)胞的抑制率明顯增加，且濃度增加細(xì)胞的抑制率；
　　 3.不同濃度LPS可以使蛻膜細(xì)胞發(fā)生明顯的超微結(jié)構(gòu)改變，且隨LPS的濃度逐漸增加細(xì)胞器損傷逐漸加重。
　　 第三部分 LPS致蛻膜細(xì)胞中孕激素受體改變的研究。
　　 目的：
　　 研究LPS感染體外培養(yǎng)的蛻膜細(xì)胞中孕激素受體和細(xì)胞因子核酸和蛋白質(zhì)的表達(dá)差異。
　　 方法：
　

15、　 取第三代蛻膜細(xì)胞，加入LPS使終濃度分別0ng/ml(對(duì)照組)，25ng/ml(研究1組)，50ng/ml(研究2組)，100ng/ml(研究3組)，200ng/ml(研究4組)，在加藥48h后用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈法(RT-PCR)測(cè)PR、TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA水平表達(dá)差異；用蛋白印跡法(Western Blot)從蛋白質(zhì)水平分析蛻膜細(xì)胞受LPS作用后PR、NF-κB表達(dá)的差異。
　　 結(jié)果：
　

16、　 1.不同濃度LPS作用后，PR的mRNA出現(xiàn)較明顯的遞減趨勢(shì)，研究組1、2、3和對(duì)照組比較，PR mRNA有減少，但改變不明顯(P>0.05)；研究組4與對(duì)照組比較PR mRNA明顯減少(P<0.05)，且與研究組1、2、3組比較也明顯減少(P<0.05)。2.不同濃度LPS作用，TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA均出現(xiàn)較明顯的遞增趨勢(shì)，研究組和對(duì)照組比較TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA明顯增加(P<0.05

17、)，研究組各組間比較TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA豐度有增加，但改變不明顯(P>0.05)。3.研究組的蛻膜細(xì)胞PR蛋白表達(dá)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著LPS的濃度逐漸增加，PR蛋白的表達(dá)也逐漸減弱；研究組的蛻膜細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著LPS的濃度逐漸增加，NF-κB蛋白的表達(dá)也逐漸增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.不同濃度LPS可以誘導(dǎo)蛻膜細(xì)胞PR mR