4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的研究.pdf

1、目的:胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,近幾年發(fā)病率呈上升趨勢(shì),且發(fā)病亦趨于年輕化,而進(jìn)展期胃癌的綜合治療效果較差,其5年生存率徘徊在30％左右。其難以治愈的原因之一與腫瘤的免疫逃逸有關(guān),抗腫瘤免疫以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主,T細(xì)胞的活化需雙信號(hào)刺激,其中第二信號(hào)由抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell,APC)上的共刺激分子與T細(xì)胞上的相應(yīng)配體提供,缺乏第二信號(hào)的作用可導(dǎo)致T細(xì)胞特異性無(wú)應(yīng)答反應(yīng)。大量研究證實(shí)腫瘤細(xì)

2、胞可通過(guò)缺乏共刺激分子的方式逃避機(jī)體免疫。
　　 樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞,能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)并維持初始免疫反應(yīng)。其功能表現(xiàn)在識(shí)別和吞噬病原體,將大分子抗原加工成肽段,刺激未致敏T細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。用樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療腫瘤是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,在諸多類型的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗中更多研究者將目光集中在用全腫瘤信息負(fù)載DC,以多個(gè)抗原表位的免疫反應(yīng),有效地防止由于抗原變異而

3、引起的免疫逃避。
　　 4.1BB/4-1BBL是CD28/B7之外的另一對(duì)重要的協(xié)同刺激信號(hào),4-1BBL屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員,主要表達(dá)于活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞上。主要在初次免疫應(yīng)答的后期起作用,4-1BBL可協(xié)同CD28或單獨(dú)發(fā)揮對(duì)靜止T細(xì)胞的活化作用,維持T細(xì)胞的生存及免疫記憶應(yīng)答。
　　 本研究將4-1BBL基因?qū)胛赴┘?xì)胞,并提取此胃癌

4、細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞制備腫瘤疫苗,并觀察疫苗的體外抗腫瘤效應(yīng),為胃癌的臨床免疫治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1：用脂質(zhì)體法把pMKITneo/4-1BBL基因?qū)?15小鼠前胃癌細(xì)胞MFC內(nèi),G418進(jìn)行篩選至長(zhǎng)出G418抗性克隆,成為MFC/4-1BBL細(xì)胞。
　　 2：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT

5、-PCR)鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中4-1BBL基因mRNA的存在。
　　 3：自615小鼠骨髓組織中分離樹(shù)突狀細(xì)胞(DC),并進(jìn)行體外培養(yǎng)使之進(jìn)一步成熟。
　　 4：用脂質(zhì)體包裹MFC/4-1BBL細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞,制備DC/4-1BBL/RNA疫苗。
　　 5：取615同種異體小鼠脾淋巴細(xì)胞,與DC、MFC/4-1BBL/DC混合培養(yǎng),利用MTT法測(cè)各組淋巴細(xì)胞增值率。DC、MFC/4-1BBL/DC與小鼠

6、淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后刺激T細(xì)胞產(chǎn)生特異性CTL細(xì)胞,利用MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞的殺傷率;ELISA法測(cè)定幼稚DC、DC、MFC/4-1BBL/DC培養(yǎng)上清中IL-12的含量及MFC/4-1BBL/DC、DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1：4-1BBL基因轉(zhuǎn)染MFC細(xì)胞后的鑒定:
　　 MFC經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染4-1

7、BBL基因、G418篩選后,均獲得陽(yáng)性克隆(MFC/4-1BBL)。提取MFC/4-1BBL細(xì)胞總RNA,經(jīng)RT-PCR可得到616bp的特異性條帶,證實(shí)有4-1BBL的mRNA較強(qiáng)表達(dá)。
　　 2：樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察;
　　 倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)第3天,細(xì)胞數(shù)量明顯增加,體積增大,部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)并聚集成團(tuán),呈集落樣生長(zhǎng)。培養(yǎng)第5天,以懸浮生長(zhǎng)為主,體積無(wú)明顯變化,部分細(xì)胞出現(xiàn)足狀突起或毛刺狀突起,集落明顯增多。

8、轉(zhuǎn)染后12h,細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)至未轉(zhuǎn)染前狀態(tài)。
　　 3：MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后DC對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖能力:
　　 刺激細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞比值分別為1:20、1:10、1:5時(shí)各組MFC/4-1BBL/DC對(duì)T細(xì)胞的增殖作用(0.093±0.012、0.187±0.013、0.187±0.013)均強(qiáng)于相應(yīng)比值下DC對(duì)T細(xì)胞的增殖作用(0.060±0.014、0.148±0.017、0.195±0.015);且隨刺激細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)

9、胞比值增高,增值作用逐漸增強(qiáng)。
　　 4：MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后DC激活T細(xì)胞殺傷腫瘤的活性:
　　 靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞比值分別為1:20、1:10、1:5時(shí)各組MFC/4-1BBL/DC激活CTL細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率(0.533±0.092、0.321±0.018、0.218±0.025)高于DC激活CTL細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率(0.342±0.023、0.267±0.0243、0.147±0.031),P＜0.05;且

10、隨效靶比增大,殺傷率逐漸增高。
　　 5：ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液上清中IL-12、IFN-γ的含量:
　　 IL-12由多到少依次為MFC/4-1BBL/DC(20.240±2.494 pg/ml)、DC(17.088±3.933 pg/ml)、幼稚DC(10.288±2.390pg/ml),DC明顯高于幼稚DC。MFC/4-1BBL/DC(9.451±2.925 pg/ml)與T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量高于DC

11、組(5.979±1.639 pg/ml)。
　　 結(jié)論:
　　 1：4-1BBL基因應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后,可以在小鼠胃癌MFC細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá);且應(yīng)用轉(zhuǎn)染后的MFC細(xì)胞的總RNA轉(zhuǎn)染DC后可以得到穩(wěn)定活性的DC疫苗。
　　 2：MFC/4-1BBL/DC對(duì)T細(xì)胞的增殖作用強(qiáng)于DC;且MFC/4-1BBL/DC培養(yǎng)液上清中IL-12的含量明顯高于其余各組。提示此疫苗可提高T細(xì)胞增殖能力及機(jī)體免疫力。
　　 3：