BDNF基因修飾骨髓基質細胞脊髓內移植對損傷脊髓的影響其機制初探.pdf

1、本文通過構建攜帶腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophfactor，BDNF)的真核表達載體PcDNA3．1-BDNF，用脂質體法轉染骨髓基質干細胞，觀察在BMSCs中的過量表達對移植細胞體外分化的影響，同時將其移植到脊髓損傷模型大鼠脊髓組織，評估功能恢復情況并通過免疫組織化學分析大鼠損傷脊髓caspase-3的表達。探討B(tài)MSCs治療脊髓損傷新途徑。 實驗材料與方法： 一、BMSCs的培養(yǎng)

2、： 1、采用原代培養(yǎng)進行BMSCs的培養(yǎng)； 2、采用免疫熒光染色法對培養(yǎng)的BMSCs進行鑒定，進行CD44染色； 3、BMSCs向神經元樣細胞的定向誘導分化，進行NSE、GFAP染色； 二、真核表達載體的構建及細胞轉染： 1、從挪威大鼠血清中提取DNA，構建真核表達載體PcDNA3．1-BDNF并鑒定； 2、離子脂質體法轉染BMSCs細胞并篩選； 3、采用Western Blott

3、ing檢測基因轉染細胞中BDNF蛋白的表達； 4、RT-PCR鑒定BDNF轉染BMSCs中基因的表達； 三、動物模型制作及細胞移植： 1、采用改良的ALLen’s打擊法制作脊髓損傷動物模型。 2、隨機分為脊髓挫傷對照組(A組)；脊髓挫傷后BMSCs組(B組)；脊髓挫傷后轉BDNF的BMSCs組(C組)。分為術后1，3，7，21天4個時相點，每個時相點每組6只大鼠。 3、BMSC和轉染后的BMSCs

4、移植入大鼠損傷脊髓局部； 四、結果檢測 1、用改良的Tarlov評分進行行為學檢查； 2、免疫組織化學反應檢測caspase-33、所有數據均以x±s表示，采用SPSS統計軟件進行分析，數據采用q檢驗(Newman_keul s法)和t檢驗進行統計分析。 實驗結果： 1、BMSCs的生長與鑒定24小時后見少量細胞貼壁生長，呈圓形、發(fā)亮，大部分細胞仍浮在培養(yǎng)液中。隨著時間延長，貼壁細胞增多，分布不均

5、，呈集落趨勢生長。一周后呈纖維狀密集生長。在細胞覆蓋約80％培養(yǎng)瓶底時傳代，傳至第2-3代時應用免疫熒光方法鑒定BMSCs標志抗原CD44，熒光鏡下見陽性細胞呈淡綠色熒光，在同一視野下觀察明視野下細胞生長，同熒光視野相比較，9596以上細胞為CD44陽性細胞。 2、BMSCs的體外定向誘導分化及免疫組織化學檢測BMSCs經正常脊髓提取液和BDNF誘導24小時后，部分細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。這些細胞胞體變小，胞質向核周收縮，由原來的

6、梭形變成圓形。隨著時間的延長，神經元樣細胞增多。取誘導14天的細胞進行免疫組化染色，大多數細胞呈NSE、GFAP陽性，呈棕褐色，胞體和突起均有表達。NSE陽性細胞率為79.7％±2.6％，GFAP陽性細胞率為66.8％±5.7％。對照組細胞NSE，GFAP的表達很少。 3、BDNF基因重組體的鑒定從大鼠基因組DNA中PCR擴增BDNF基因，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，片段大小符合預期，陰性對照組無片斷擴增出。用BDNF上下游引物pB

7、DNFf和pBDNFr對構建好的PcDNA3．1-BDNF進行PCR分析電泳，并經過DNA序列測定證實目的基因已插入重組質粒。 4、RT-PCR與Western Blotting顯示篩選出的G418抗性BDNF轉染BMSCs中有BDNF蛋白的明顯表達。 5、行為學檢查情況術后1d A組、B組、C組大鼠都表現為雙后肢癱瘓，行為學觀察無明顯差別。7d時B組、C組大鼠運動功能明顯好于A組(P<0.05)，21d時B組、C組大鼠

8、已能行走，A組大鼠則行走困難。 6、脊髓損傷后caspase-3免疫反應陽性細胞數的變化術后1d各組脊髓caspase-3免疫反應陽性細胞都明顯增加，A、B兩組增加顯著。術后3d、7d C組caspase-3免疫反應陽性細胞增加較少。術后1-14d其他各組與A組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。 研究結論： 1、BMSCs可在體外經BDNF與脊髓提取物定向誘導為神經元樣細胞。 2、脂質體法介導的外源