鈣調(diào)素拮抗劑EBB逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的實驗研究.pdf

1、目的：多藥耐藥(MDR)給腫瘤化療帶來了極大困難，是腫瘤患者死亡的最主要原因。針對復(fù)雜的腫瘤多藥耐藥機制開發(fā)新的藥理學(xué)制劑逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR是過去十多年一直努力的最主要目標。將鈣調(diào)素拮抗劑小檗胺類衍生物0-4-乙氧基-丁基-小檗胺[EBB]應(yīng)用于腫瘤耐藥的逆轉(zhuǎn)，尋求能夠有效逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的耐藥逆轉(zhuǎn)劑。 方法：采用四唑鹽(MTT)比色法在體外評價EBB逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的療效和毒性，并利用RT-PCR、Westernblot、免疫共沉淀法、

2、PI單染、TUNEL分析、DNAladder、流式細胞儀(FACS)、熒光共聚焦顯微鏡等方法和技術(shù)探索其逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的分子機制。 結(jié)果：(1)在正常細胞ECV304(人臍靜脈內(nèi)皮細胞)中EBB基本無毒性，而在其余16種人腫瘤細胞系包括四對敏感和耐藥細胞系中，EBB的IC50值在4.55-15.74μM，提示腫瘤耐藥細胞系對EBB不產(chǎn)生交叉耐藥，而且EBB也不是P-糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)外排泵的底物；

3、 (2)在MCF-7/ADR和MCF-7細胞中阿霉素(ADR)的IC50值分別為128.6μM和1.1μM，而在K562/A02和K562細胞中的IC50值分別為206.3μM和1.5μM；低劑量(＜IC30)EBB在體外能夠逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR和K562/A02細胞對DOX的耐藥，可以達到相應(yīng)的敏感細胞的水平，且作用持續(xù)時間超過48小時，明顯強于第一代耐藥逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米(VPL)，而對相應(yīng)的敏感細胞MCF-7和K562卻無增敏作用

4、； (3)在K562/G01和K562細胞中，EBB不能逆轉(zhuǎn)K562/G01對格列衛(wèi)的耐藥，即使提高EBB的劑量也無效； (4)金正均方法分析表明低劑量合并用藥時，在MCF-7/ADR、MCF-7、K562/A02、K562四個細胞系中EBB和DOX呈現(xiàn)理想的協(xié)同增效作用； (5)體外研究也證明EBB能夠增加腫瘤耐藥細胞MCF-7/ADR、K562/A02對化療藥物DOX分子的攝入，抑制Pgp底物羅丹明123(R

5、h123)的外排，而對Pgp的表達和多藥耐藥相關(guān)基因mdr1，拓撲異構(gòu)酶Ⅱb的表達并無影響； (6)TUNEL分析表明化療藥DOX能夠誘導(dǎo)MCF-7敏感細胞凋亡，而MCF-7/ADR耐藥細胞出現(xiàn)了凋亡耐受現(xiàn)象。同時，EBB單獨用藥能直接引起腫瘤耐藥細胞的調(diào)亡。共聚焦顯微鏡觀察到腫瘤耐藥細胞MCF-7/ADR和其相應(yīng)的敏感細胞MCF-7內(nèi)不同的鈣離子分布，后者的水平明顯高于前者。值得注意是鈣離子在兩種細胞內(nèi)的定位也存在明顯的差異。

6、EBB能夠明顯增加耐藥細胞內(nèi)鈣離子濃度，甚至能夠達到敏感細胞內(nèi)的水平。因此可以認為，增加耐藥細胞凋亡是EBB逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的另一個機制。由于鈣離子和細胞凋亡的關(guān)系密切，EBB可能是通過調(diào)節(jié)耐藥細胞內(nèi)的鈣離子水平及區(qū)域分布引起耐藥細胞的凋亡； (7)PI單染分析表明EBB與DOX合用時能引起MCF-7/ADR耐藥細胞G2/M期阻滯。Westernblot分析顯示EBB能夠下調(diào)細胞周期蛋白cyclinB1和cdc2-p34即細胞周期素

7、依賴激酶1(cdk1)的表達，而對其cdc2的磷酸化無影響，是G2/M期阻滯的主要原因。 結(jié)論：首先，EBB具有高效的逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用，這種作用的機制并不局限于抑制Pgp的功能；其次，它對正常細胞無毒性，而且DOX聯(lián)合用藥時呈現(xiàn)的是協(xié)同增效作用。事實上，MDR的產(chǎn)生機制非常復(fù)雜。一種腫瘤耐藥細胞可能同時存在多種耐藥機制，針對一種機制很難達到理想的效果。合并應(yīng)用有協(xié)同作用的逆轉(zhuǎn)劑可以減少化療藥的劑量降低毒性。EBB有望成為新的