單核細胞TLR7和TLR8的表達及功能與HIV感染關系的研究.pdf

1、目的：
　　 近二十年來研究者們一直致力于獲得性免疫對HIV感染的免疫應答研究,但到目前為止在免疫治療和疫苗方面尚無突破性進展。近來研究顯示,在HIV感染中天然免疫系統(tǒng)可能占有非常重要的地位。天然免疫系統(tǒng)即是機體抵御外來病原微生物入侵的第一道防線,同時又在調節(jié)獲得性免疫中發(fā)揮著重要的作用,單核細胞是天然免疫系統(tǒng)的重要細胞,其表達具有高度同源性的Toll樣受體7和8(Toll-LikeReceptor7 and8,TLR7和8),

2、能夠識別病毒單鏈RNA(ssRNA),活化核因子NF-κB,促進細胞因子IL-12p40、TNF-α等的分泌。最近研究發(fā)現(xiàn)TLR7和8能夠識別HIV-1長末端重復序列(HIV-1 LTR)上富含尿嘧啶的ssRNA(ssRNA40)。單核細胞TLR7和8的表達是否與HIV感染的疾病進程有關,是否為HW感染者疾病進展緩慢的保護因素,目前尚無文獻報道。TLR7和8的表達水平能否影響其介導的單核細胞分泌的細胞因子水平,亦無文獻報道。TLR7和8

3、介導的NF-κB的活化能夠同時促進Ⅰ型和Ⅱ型細胞因子的產(chǎn)生,且在HIV-1 LTR上存在著NF-κB的結合位點,能夠與NF-κB結合促進HIV的復制,可見單核細胞TLR7和8活化能夠介導的雙重作用,那么它如何影響HIV的復制呢?目前尚無明確的結論。本文首次研究了不同疾病進程的HIV感染者單核細胞的TLR7和8表達水平和其介導的細胞因子分泌功能以及對HIV復制的影響,初步探討了HIV感染者單核細胞TLR7和8表達及其介導的信號對HIV感染

4、疾病進程的影響及可能的致病機制。
　　 方法：
　　 1、研究對象
　　 由遼寧省疾病預防與控制中心,河南省疾病預防與控制中心和中國醫(yī)科大學艾滋病研究所艾滋病確認實驗室經(jīng)Western blot試驗確認為HIV陽性的HIV/AIDS患者。根據(jù)HIV/AIDS患者CD4+T細胞數(shù)量和感染時間不同,分成三組:緩慢進展組,CD4+T淋巴細胞≥500個/μl,感染HIV10年以上,未經(jīng)抗病毒治療,無艾滋病指征性癥狀;HI

5、V感染組,CD4+T淋巴細胞≥200個/μl,無艾滋病指征性疾病;AIDS病組,CD4+T淋巴細胞＜200個/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病。HIV抗體陰性的健康對照來自本院健康體檢門診的體檢者,血液系統(tǒng)及肝腎功能檢查結果正常,無免疫系統(tǒng)000疾病史。
　　 2、標本采集
　　 用10毫升EDTA抗凝負壓真空采血管采集研究對象外周靜脈血,在6小時內進行試驗。
　　 3、T淋巴細胞絕對值和比值測定
　　 將20

6、μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入絕對計數(shù)管中,應用反向加樣法加入50μl抗凝血,室溫避光15min,加入免洗溶血素450μl,室溫避光15min,FACSMULTISET軟件檢測并進行自動分析,計算CD4+T淋巴細胞絕對值。
　　 4、密度梯度離心法分離外周血單個核細胞
　　 離心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液14ml,沿管壁緩慢加入用PBS稀釋后的抗凝全血30ml,離心400g,

7、30min。用毛細管吸取界面層的PBMC,移入另一試管中。加入5倍體積的PBS緩沖液,洗細胞2次。
　　 5、CD14+單核細胞分選
　　 采用德國Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分選裝置,嚴格按照說明書進行操作。每10M細胞加20μl抗CD14免疫磁珠,4℃結合15min,300g離心10 min,500μl緩沖液重懸細胞,經(jīng)LS柱子進行陽性分選。取少量細胞加入20μl CD3-FITC、20μl CD14-PE

8、及20μl CD4-PerCP,用流式細胞儀Cellquest軟件檢測分選細胞純度。
　　 6、單核細胞體外培養(yǎng)及刺激
　　 將分選的單核細胞用含有1％PS,2mmol/L的L-谷氨酰胺,25mmol/L HEPES緩沖液,10％胎牛血清的RPMI1640調整濃度為1×106/mL,培養(yǎng)于48孔板中,所用的培養(yǎng)基及材料均不含內毒素。用2.5μg/ml的R848刺激單核細胞,于37℃5％的CO2孵箱中培養(yǎng),對照組加入同體積

9、的PBS,每個樣本設3個復孔,24小時后收集上清和細胞.
　　 7、制備細胞RNA
　　 按照QIAGEN公司細胞RNA提取試劑盒的說明書進行操作,通過全自動紫外分光光度儀檢測所得RNA的質量和濃度。
　　 8、引物及探針的設計和合成
　　 上述引物經(jīng)BLAST分析,匹配率為100％。
　　 9、標準品質粒的構建
　　 逆轉錄反應按照TaKaRa公司試劑盒說明書進行,RT反應體系為總RNA

10、500ng,隨機引物Oligo dT(50μM)0.5μl,Random6 mers(100μM)0.5μl,5×PrimeScriptBuffer2μl,PdmeScript RT Enzyme Mix I0.5μl,用Rnase Free dH2O補齊10μl。反應條件為37℃15 min,85℃5see,4℃終止反應,所得cDNA-20℃凍存?zhèn)溆谩＠蒙鲜鲆镞M行RT-PCR擴增TLR7、TLR8和GAPDH,PCR產(chǎn)物膠回收純化

11、后克隆到pUCmT-vector,轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌中,藍白篩選后獲得陽性克隆,測序驗證。純化重組質粒,紫外分光光度計定量后根據(jù)分子量換算為分子拷貝數(shù),稀釋標準質粒,產(chǎn)生梯度濃度:109、107、105、103、10作為標準品質粒。
　　 10、實時定量PCR
　　 采用SYBR Green法,應用ABI7500熒光定量PCR儀進行定量檢測,以GAPDH為內參照,標準曲線法進行定量。反應體系為25μl,其中S

12、YBR Premix Ex Taq12.5μl,ROX Reference DyeII0.5μl,上下游引物各0.5μl,cDNA模板1μl,H2O10μl。反應條件為:95℃5sec,60℃34sec,40個循環(huán),溶解曲線的條件為95℃15 sec,60℃1 min,95℃15 sec。反應結束后電腦用不同濃度標準品質粒的拷貝數(shù)和CT值自動繪出標準曲線,并可根據(jù)待測樣本目的基因和內參基因的CT值計算出TLR7和TLR8mRNA的拷貝數(shù)

13、。每一份標本均行復管檢測,取其均值做為目的基因的表達水平。
　　 11、TNF-α和IL-12p40的檢測
　　 采用ELISA方法,按照TNF-α和IL-12p40試劑盒的說明書進行操作,定量檢測單核細胞培養(yǎng)上清中的TNF-α和IL-12p40的含量。
　　 12、EasyQ測定HIV病毒載量
　　 樣本量200μl,檢測范圍為＞10U/ml.
　　 13、統(tǒng)計學處理
　　 所有資料采用

14、SPSS11.5軟件分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用LSD檢驗對不同患者組和健康對照組進行兩兩比較,Pearson進行相關性分析,不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann-Whitngy U test進行比較,Spearman rank進行相關性分析,數(shù)據(jù)處理成均值±標準誤,統(tǒng)計概率采用雙側檢驗,P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、HIV/AIDS患者外周血單核細胞TLR7和TLR8的mRNA表達
　　 T

15、LR7 mRNA的表達:緩慢進展組高于HIV感染組、AIDS組和健康對照組,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05):HIV感染組高于AIDS組,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);健康對照組高于AIDS組,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HIV感染組與健康對照組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);TLR8 mRNA的表達:緩慢進展組和健康對照組高于AIDS組,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);緩慢進展組高于HIV感染組,HIV感染組高于AIDS組,沒有統(tǒng)計學意

16、義(P＞0.05);緩慢進展組高于健康對照組,健康對照組高于HIV感染組,沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2、HIV/AIDS患者單核細胞TLR7和TLR8 mRNA的表達水平與CD4細胞數(shù)量的相關性
　　 63例HIV/AIDS患者單核細胞TLR7mRNA的表達水平與CD4+細胞數(shù)量呈顯著正相關(r=0.614,P＜0.01);TLR8mRNA的表達水平與CD4+細胞數(shù)量呈顯著正相關,(r=0.419,P＜0.

17、01)。
　　 3、TLR7和8介導的mV感染者單核細胞分泌TNF-α和IL-12p40
　　 水平:
　　 外周血單核細胞體外培養(yǎng)上清中未檢測到TNF-α和IL-12p40。經(jīng)TLR7和8的配體R848刺激后TNF-α和IL-12p40的分泌水平顯著增加(P＜0.001)。健康對照組TNF-α的分泌水平為2708.9±370.3pg/ml,顯著高于HIV感染組1776.04±479.46pg/ml(P=0.04

18、12);健康對照組IL-12p40的分泌水平為393.8±25.7pg/ml,HIV感染組為519.74±87.9pg/ml,沒有統(tǒng)計學意義(P=0.414)。
　　 4、TLR7和8介導的單核細胞分泌TNF-α和IL-12p40的水平與CD4+T細胞絕對數(shù)的相關性
　　 經(jīng)Pearson相關分析得出,10例HIV感染者TLR7和8介導的單核細胞分泌TNF-α(r=0.864,P=0.0013)和IL-12p40(r=0

19、.774,P=0.0086)的水平與CD4+T淋巴細胞絕對值呈明顯正相關,且TNF-α與IL-12p40的分泌水平也呈明顯正相關(r=830,P=0.003)
　　 5、單核細胞TLR7和8經(jīng)R848活化后表達變化
　　 R848刺激單核細胞后TLR7表達明顯下調(P=0.025,Wilcoxon秩和檢驗),TLR8表達沒有明顯變化(P＞0.05)。
　　 6、單核細胞TLR7的表達水平與TNF-α和IL-12p

20、40分泌水平的關系
　　 HIV感染者單核細胞TLR7表達與其介導的TNF-α和IL-12p40的分泌水平?jīng)]有相關性(P＞0.05)。單核細胞TLR7表達的下調水平與TNF-α和IL12-p40分泌水平也沒有相關性(P＞0.05)。
　　 7、單核細胞培養(yǎng)上清中HIV病毒載量與CD4+T細胞數(shù)量的關系
　　 9例HIV感染者中,有6例HIV感染者單核細胞培養(yǎng)上清中出現(xiàn)低水平的HIV復制,3例未檢測到HIV復制。為

21、了解CD4+T細胞與HIV復制水平的關系,我們將6例出現(xiàn)HIV復制的HIV感染者按照CD4+T細胞數(shù)量分為兩組(＞400/ml和＜400/ml),發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞數(shù)＜400/ml組的HIV病毒載量顯著高于CD4+T細胞數(shù)量＞400/ml組(P=0.031)。
　　 8、R848刺激單核細胞TLR7和8后對單核細胞內HIV復制的作用
　　 9例HIV感染者的單核細胞體外經(jīng)R848刺激后有5例HIV復制水平顯著降低(P=0

22、.043,Wilcoxon檢驗),有1例HIV的復制升高,3例HIV感染者單核細胞經(jīng)R848刺激前和刺激后均未檢測出HIV復制。
　　 結論：
　　 1、HIV/AIDS患者不同疾病進程外周血單核細胞TLR7和TLR8表達水平不同,緩慢進展組高于HIV感染組,HIV感染組高于AIDS組;
　　 2、HIV/AIDS患者外周血單核細胞TLR7和TLR8表達水平與CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)明顯正相關;
　　 3

23、、TLR7的活化能夠引起自身表達的下調,TLR8的活化未引起自身表達的變化;
　　 4、TLR7和8能夠介導單核細胞分泌細胞因子,細胞因子分泌水平與機體的免疫狀態(tài)有關。HIV感染者單核細胞TLR7和8介導的細胞因子分泌水平具有保護性調節(jié)作用;
　　 5、HIV感染者外周血單核細胞中存在可復制的HW病毒顆粒,且復制水平與機體免疫狀態(tài)有關;
　　 6、HIV感染者單核細胞TLR7和8的活化能夠抑制HIV復制,這種抑制