AF-hTERT-TK-GCV靶向抗肝癌及旁觀者效應的研究.pdf

1、端粒酶是核糖核蛋白復合體，其主要功能是增加染色體末端端粒的不斷重復以維護它的穩(wěn)定性和細胞的惡性增殖。端粒酶包括兩個基本成分，端粒酶RNA模板hTR和催化亞單位hTERT(端粒酶逆轉錄酶)。hTERT是端粒酶的最重要成分，它能催化全酶的活性，其啟動子是這一功能的核心，因為它僅在有端粒酶活性的腫瘤細胞內表達，因此hTERT可作為一個較為理想的腫瘤治療靶點，以此為突破點，自殺基因可達到靶向治療肝癌的目的。 目的： 構建去唾液酸

2、糖蛋白(AF)-pGL3-人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子-胸甘激酶(TK)，即AF-pGL3-hTERT-TK復合物，通過脂質體轉染方法將其轉染入腫瘤細胞后，觀察其對肝癌細胞株HepG2生長及凋亡的影響。 方法： 1.細胞培養(yǎng)；2.通過酶切產物的連接，構建熒光報告質粒組和治療質粒組；3.制備AF標記的脂質體，通過脂質體轉染法轉入人肝癌細胞HepG2和正常肝細胞L-02；4.用熒光顯微鏡，液閃計數(shù)儀觀察熒光報告質粒轉

3、染細胞后的熒光，以及hTERT啟動子在細胞中驅動熒光基因表達的強弱；5.用TUNEL方法，流式細胞儀技術觀察治療質粒轉染細胞后對細胞生長，凋亡及旁觀者效應的情況；6.Westernblotting技術觀察轉染.AF-pGL3-hTERT-TK后肝癌細胞周期蛋白調控因子的表達情況。 結果： 1.成功構建熒光報告質粒組：pGL3-basic(陰性對照)、pGL3-control(陽性對照)、pGL3-hTERT-Luc+；治

4、療質粒組：pGL3-basic-TK(陰性對照)、pGL3-control-TK(陽性對照)、pGL3-hTERT-TK。 2.使用LuciferaseAssay檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，pGL3-hTERT-Luc+轉染HepG2細胞后的相對活性是pGL3-control的60％，但明顯高于陰性對照pGL3-basic；但是pGL3-hTERT-Luc+轉染端粒酶陰性的L-02細胞后其熒光活性僅為pGL3-Control的13％，說明在肝

5、癌細胞中hTERT啟動子有強大的轉錄活性；相比之下，pGL3-hTERT-Luc+質粒在端粒酶陰性的正常肝細胞L-02中熒光素酶的表達很弱。 3.在肝癌細胞中TK(基因可以被hTERT啟動子驅動高效的表達，幾乎不影響正常肝細胞L-02的生長；AF-通過識別ASGPR受體結合到HepG2細胞表面，其攜帶的TK基因更易進入肝癌細胞，同時增強自殺基因TK的表達效果，在旁觀者效應機制的參與下，肝癌細胞總的凋亡率達85％±3％，而正常肝細