急性中長波紫外線輻射“旁觀者效應(yīng)”相關(guān)分泌型miRNA的篩選及其功能預(yù)測.pdf

1、研究背景及目的
　　輻射包括電離輻射和非電離輻射。紫外線(ultraviolet，UV)是波長為100-400nm的非電離輻射。根據(jù)紫外線波長的不同，可將其分為短波紫外線UVC(200-280 nm)、中波紫外線UVB(280-320 nm)和長波紫外線UVA(320-400nm)。而在透過大氣層時(shí)波長小于290nm的紫外線會被大氣層中的臭氧吸收掉，能夠到達(dá)地面的主要是UVA和少量UVB。
　　輻射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)(Byst

2、ander effects，BE)是指旁觀者細(xì)胞出現(xiàn)諸如細(xì)胞死亡、基因突變、染色體不穩(wěn)定等類似于細(xì)胞直接受到輻射作用后出現(xiàn)的反應(yīng)。旁觀者細(xì)胞指與受輻射細(xì)胞鄰近的細(xì)胞，也指用受輻射細(xì)胞的上清液培養(yǎng)的細(xì)胞。紫外線除了引起受輻射細(xì)胞的直接損傷外，還可以通過紫外線輻射旁效應(yīng)（Ultraviolet irradiation induced bystander effects，UV-BE）引起臨近細(xì)胞的間接損傷，這些旁觀者效應(yīng)包括氧化應(yīng)激反應(yīng)，基因

3、突變，凋亡，炎癥反應(yīng)，免疫抑制，甚至腫瘤病變等。為了消除紫外線輻射所帶來的這些影響，維持染色體健全，細(xì)胞產(chǎn)生了一系列保護(hù)機(jī)制，包括DNA修復(fù)，細(xì)胞周期阻滯以及凋亡。在旁觀者效應(yīng)中，受輻射細(xì)胞的DNA損傷反應(yīng)通過細(xì)胞間縫隙連接、細(xì)胞外可溶性因子與未受輻射細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞間通信。
　　最近的研究表明小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)在受輻射細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞的信號通路中扮演重要的角色。以往人們都認(rèn)為miRNA只在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，

4、然而隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA也會被分泌到細(xì)胞間隙中并發(fā)揮功能。大量的數(shù)據(jù)表明其實(shí)細(xì)胞外的miRNA十分穩(wěn)定，miRNA之所以能在細(xì)胞間隙中穩(wěn)定存在，是因其包裹于細(xì)胞外囊泡中，細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是由磷脂雙分子層封閉組成不同大小的微粒(20～2000 nm)，在體內(nèi)和體外幾乎所有類型的細(xì)胞都會釋放EVs到細(xì)胞外介質(zhì)中。到目前為止，根據(jù)不同的形成機(jī)制和生理特征分成三不同的EVs形式:

5、外泌體、細(xì)胞膜微粒、調(diào)亡小體。外泌體產(chǎn)生于核內(nèi)體攜帶的多泡體，細(xì)胞膜微粒和調(diào)亡小體來源于細(xì)胞質(zhì)膜釋放的微囊泡(Microvesicles，MVs)。被包裹在EVs中的miRNA稱為“分泌型miRNA”，EVs保護(hù)“分泌型miRNA”，使其免受各種酶類的降解，從而被運(yùn)輸?shù)较鄳?yīng)的受體細(xì)胞并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物功能。那么，在紫外線輻射“旁觀者效應(yīng)”中細(xì)胞的損傷是否由其中的miRNA介導(dǎo)或者由何種miRNA介導(dǎo)呢？本研究的目的在于篩選出有可能在急

6、性中長波紫外線輻射“旁觀者效應(yīng)”中發(fā)揮重要作用的分泌型miRNA，并預(yù)測其可能的機(jī)制。
　　方法
　　1、紫外線輻射“旁觀者效應(yīng)”模型的建立及驗(yàn)證
　　分別采用不同劑量中長波紫外線(Ultraviolet A/Ultraviolet B，UVA/UVB)UVA20J/cm2、UVB60mJ/cm2輻射人皮膚成纖維細(xì)胞（human skin fibroblasts，HSF），用特別配置的無胞外囊泡培養(yǎng)基孵育HSF，于照射

7、后24h提取細(xì)胞上清液，與正常HSF共育，分為對照組（Ctr組）、UVA輻射組（UVA組）、UVB輻射組(UVB組)、旁觀者細(xì)胞對照組（BE-Ctr組）、旁觀者細(xì)胞UVA組（BE-UVA組）、旁觀者細(xì)胞UVB組（BE-UVB組），比較直接受輻射細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞的變化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，DCFH-DA試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS量。
　　2、miRNA芯片篩選差異表達(dá)

8、的分泌型miRNA及生物信息學(xué)分析
　　采用以上劑量中長波紫外線輻射人皮膚成纖維細(xì)胞，用無胞外囊泡培養(yǎng)基孵育24h，收集直接受輻射細(xì)胞各組上清液，進(jìn)行miRNA芯片分析，以歸一化強(qiáng)度的|log2(Ratio)|≥5為條件篩選上述模型中差異表達(dá)的上調(diào)miRNA、下調(diào)miRNA，利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)法驗(yàn)證UVA vs Ctr組、UVB vs Ctr組差異倍數(shù)均大于5倍的上調(diào)miRNA。通過TargetScan、microRNAorg

9、、PITA數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，并對所得差異miRNA的靶基因進(jìn)行GO分析以及pathway富集分析。
　　3、qRT-PCR法深入驗(yàn)證差異表達(dá)的分泌型miRNA
　　利用qRT-PCR（Quantitative real time PCR，實(shí)時(shí)定量PCR）實(shí)驗(yàn)法對上述差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行深入驗(yàn)證，分別檢驗(yàn)直接受輻射細(xì)胞、直接受輻射細(xì)胞上清液和旁觀者細(xì)胞中miRNA的表達(dá)量，篩選出可能與紫外線“旁觀

10、者效應(yīng)”相關(guān)的分泌型miRNA;繪制差異miRNA時(shí)效曲線圖;檢驗(yàn)其前體RNA(pre-miRNA)在旁觀者細(xì)胞中的表達(dá)量。
　　結(jié)果
　　1、紫外線輻射人皮膚成纖維細(xì)胞后，可誘導(dǎo)紫外線“旁觀者效應(yīng)”的發(fā)生經(jīng)中長波紫外線UVA20J/cm2、UVB60mJ/cm2輻射誘導(dǎo)生成的上清液與旁觀者細(xì)胞共孵育后24h，倒置顯微鏡下觀察直接受輻射細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞，細(xì)胞均出現(xiàn)較多的細(xì)胞碎片，細(xì)胞體積變大，過度伸展;CCK-8結(jié)果提示細(xì)胞

11、增殖率均減緩;流式細(xì)胞法結(jié)果提示細(xì)胞均表現(xiàn)出凋亡率升高;ROS結(jié)果提示，細(xì)胞活性氧熒光強(qiáng)度均高于未輻射組。
　　2、miRNA芯片篩選出差異表達(dá)miRNA
　　紫外線輻射誘導(dǎo)生成的上清液中提取分泌型miRNA進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證并予芯片篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用差異倍數(shù)Fold change值進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為Fold change值＞=5.0，UVA vs Ctr組中有54個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)、11個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào);UVB vs Ct

12、r組中有50個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，4個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。其中，上調(diào)的miRNA中，UVA vs Ctr組Fold change值＞=5.0同時(shí)UVB vs Ctr組Fold change值＞=5.0的miRNA有19個(gè)，分別為hsa-miR-8071、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-758-3p、 hsa-miR-7515、 hsa-miR-6856-5p、 hsa-miR-6837-5p、hsa-miR-6769a-5

13、p、 hsa-miR-6743-5p、 hsa-miR-564、 hsa-miR-4694-3p、hsa-miR-4655-3p、hsa-miR-4514、hsa-miR-4513、hsa-miR-4422、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-3659、hsa-miR-3163、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-1299。對差異表達(dá)的分泌型miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測靶基因功能，UVA組與UVB組顯著富集代謝通

14、路大部分重疊，基因主要富集在能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程中，并且這些基因主要參與Rap1信號通路、粘著斑激酶(FAK)相關(guān)信號通路、MAPK信號通路等重要代謝通路。
　　3、差異表達(dá)的分泌型miRNA的進(jìn)一步驗(yàn)證
　　在直接受輻射細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞中hsa-miR-4655-3p、hsa-miR-769-5p均呈現(xiàn)高表達(dá);hsa-miR-4655-3p、hsa-miR-769-5p在24h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量最