基于生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進行附子減毒增效的研究.pdf

1、目的：建立一種能同時測定附子中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿含量的HPLC分析方法；研究生附子和制附子的HPLC指紋圖譜；篩選適合附子生物轉(zhuǎn)化的微生物；采用HPLC-MS法對轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的新物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定；通過藥理、藥效學試驗對生物轉(zhuǎn)化后的附子進行減毒增效研究。
　　 方法：①以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對照品作為對照，采用反相高效液相色譜法同時測定附子中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量。②參照中藥注射劑質(zhì)量控制中所采用的指紋圖譜技

2、術(shù)，分別對10批生附子、10批制附子以及生附子與制附子之間的HPLC圖譜進行相似度比較，建立生附子及制附子的HPLC指紋圖譜。③選用生附子粉為原料，采取固態(tài)發(fā)酵的方式，以菌種生長狀況、雙酯型生物堿含量以及新物質(zhì)的產(chǎn)生與否作為評價指標，對附子生物轉(zhuǎn)化所需菌種進行篩選。④采用HPLC-MS法對生物轉(zhuǎn)化后附子中新增產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行初步鑒定，并通過動物實驗對其減毒增效作用進行驗證和評價。
　　 結(jié)果：①試驗建立的色譜條件，能同時準確測定附

3、子中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的含量。烏頭堿進樣量在0.17～2.72μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=195555x-11910,R2=0.9995；次烏頭堿進樣量在0.13～2.08μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=335727x-16744，R2=0.9996；次烏頭堿進樣量在0.15～2.40μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=375160x-20194，R2=0.9996。三者的平

4、均加樣回收率分別為100.04％、99.99％、100.09％。方法學考察表明，該法簡單、準確、穩(wěn)定可靠。②采用國家藥典委員會頒布的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版A”計算10批生附子及10批制附子HPLC圖譜的相似度，結(jié)果表明，建立的指紋圖譜方法可靠，可以作為附子指標檢測和質(zhì)量控制的方法。③以菌種生長情況、雙酯型生物堿含量以及新物質(zhì)的產(chǎn)生與否作為評價指標，對附子生物轉(zhuǎn)化所需菌種進行篩選，結(jié)果表明，霉菌類菌種在附子的生物轉(zhuǎn)化過程中

5、生長狀況良好，雙酯型生物堿含量增加，新生物質(zhì)個數(shù)較多、含量較高且比較穩(wěn)定；細菌類菌種在附子的生物轉(zhuǎn)化過程中菌種生長狀況較差，雙酯型生物堿含量變化不大，產(chǎn)生的新物質(zhì)個數(shù)少、含量低且不穩(wěn)定。故選取霉菌中的黑曲霉作為生物轉(zhuǎn)化菌種對附子的生物轉(zhuǎn)化進行初步研究，經(jīng)黑曲霉生物轉(zhuǎn)化后的附子樣品中雙酯型生物堿含量增加，產(chǎn)生的新物質(zhì)經(jīng)HPLC-MS分析，初步判定其中一種新成分為毒性小、藥效較高的單酯型生物堿-苯甲酰烏頭堿。④減毒增效實驗結(jié)果表明，較之生附