慶大霉素作用下耳蝸內(nèi)毛細胞帶狀突觸的可塑性研究.pdf

1、背景和目的： 隨著生活水平的提高，人們對健康的要求有了和以往不同的內(nèi)容，除了生存時間，還期待更高的生活質量。在這種現(xiàn)狀下，聽力損失對人類健康的威脅得到了高度重視。藥物、衰老是引起聽力損失的主要原因。在我國，氨基糖甙類藥物導致的聽力損失位居各種致聾因素之首，作為引起感音神經(jīng)性聾的主要原因，學者們從形態(tài)、蛋白質表達、基因調(diào)控、電生理記錄等各個方面對其耳毒性機理進行了大量研究，但研究主要集中在耳蝸的內(nèi)、外毛細胞、血管紋、螺旋神經(jīng)元部位

2、。內(nèi)毛細胞帶狀突觸(ribbon synapse)，是將聲音信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一個傳入神經(jīng)突觸，它在氨基糖甙類藥物引起的聽力損失過程中發(fā)揮的作用并沒有得到關注。 耳蝸作為哺乳動物的聽覺器官，能夠編碼不同頻率和強度的聲音。耳蝸的外毛細胞對聲音頻率的有高度敏感性和選擇性，對聲音有放大作用；內(nèi)毛細胞是負責將聲音信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感受細胞。內(nèi)毛細胞將聲波的振動模擬為電信號，在內(nèi)毛細胞形成電勢差，從而刺激神經(jīng)遞質由內(nèi)毛細胞帶

3、狀突觸釋放到相應的螺旋神經(jīng)元，再由螺旋神經(jīng)元投射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。聽力損傷常常認為與內(nèi)、外毛細胞的損傷和/或螺旋神經(jīng)元細胞的變性相關。連接螺旋神經(jīng)元和內(nèi)毛細胞的帶狀突觸作為內(nèi)毛細胞和螺旋神經(jīng)元細胞之間的紐帶，是影響聲音信號傳遞的重要原因，卻一直沒有得到充份重視。 大量的研究證實，突觸傳遞的效能不是固定不變的。在突觸前神經(jīng)元興奮，通過神經(jīng)遞質的釋放，引起突觸后電位的變化，從而完成電信號的傳遞過程中，突觸本身的功能和形態(tài)都可能發(fā)生改變

4、。這種變化既可以是突觸傳遞效能的增強，也可以是突觸傳遞效能的減弱；既可以是短時程的(數(shù)秒到數(shù)分鐘)；也可以是長時程的(數(shù)小時到數(shù)周)。突觸傳遞效能的各種變化統(tǒng)稱為突觸可塑性。由于聲音信息通過聽神經(jīng)的動作電位傳遞入腦，所以帶狀突觸結構的重新排列和/或變性會對聲音編碼產(chǎn)生重要的影響。在耳蝸的某一位置內(nèi)毛細胞和傳入神經(jīng)之間信號傳遞的破壞會影響這一位置所對應的語言信號的理解。基于上述考慮，在藥物性耳聾的小鼠中，內(nèi)毛細胞帶狀突觸的形態(tài)和功能都將發(fā)

5、生改變。 由于內(nèi)毛細胞帶狀突觸所在的位置深在、數(shù)量極少，一直以來，對它的研究進展緩慢，在國內(nèi)尚未見對內(nèi)毛細胞帶狀突觸進行系統(tǒng)研究的報道。近年來隨著研究技術和實驗條件的發(fā)展，國外的研究者對內(nèi)毛細胞帶狀突觸正常生理條件下的形態(tài)、分子解剖、電生理等方面的研究取得了一定進展，使我們得以對病理狀態(tài)下的內(nèi)毛細胞帶狀突觸的結構和功能進行研究。 通過電子顯微鏡觀察，典型的耳蝸內(nèi)毛細胞的帶狀突觸為球形或橢球形的電子密度體。周圍附著單層突觸

6、囊泡。隨著聽力水平的不同，帶狀突觸的數(shù)量和形態(tài)也出現(xiàn)變化。例如，小鼠的每個內(nèi)毛細胞有16.8±2.4個帶狀突觸，而在聽閾增加之后，帶狀突觸的數(shù)量減少并且體積增大。對毛細胞電鏡超薄連續(xù)切片的重構可以得出帶狀突觸的準確數(shù)量。這些對動物正常生理情況下內(nèi)毛細胞帶狀突觸形態(tài)的研究方法和研究結果為病理條件下的進一步研究打下了良好的基礎。 本研究使用慶大霉素腹腔注射制作小鼠感音神經(jīng)性聾模型，研究感音神經(jīng)性聾發(fā)展過程早期的內(nèi)毛細胞帶狀突觸可塑性

7、變化：分別對內(nèi)毛細胞帶狀突觸的數(shù)量和功能加以研究。使用免疫熒光雙標對突觸前結構蛋白RIBEYE及突觸后膜受體蛋白GluR2—3進行標記，結合激光共聚焦顯微鏡、3d max8.0軟件三維重建對內(nèi)毛細胞帶狀突觸進行數(shù)量分析。使用免疫熒光標記及Western blotting對otoferlin蛋白質進行半定量分析，由于otoferlin在內(nèi)毛細胞帶狀突觸神經(jīng)遞質的胞吐過程中發(fā)揮著重要作用。對otoferlin蛋白質表達變化的研究能夠體現(xiàn)在慶

8、大霉素作用早期帶狀突觸功能的變化。 對藥物性耳聾時內(nèi)毛細胞帶狀突觸數(shù)量和功能變化的研究，為其它原因引起的感音神經(jīng)性聾致病機理的進一步研究打下良好的基礎，例如老年性耳聾、噪聲性耳聾時內(nèi)毛細胞帶狀突觸結構和功能的變化。可以進一步利用電鏡對內(nèi)毛細胞帶狀突觸微觀結構的變化加以研究，也可使用電生理方法對帶狀突觸的功能進行深入研究?？傊瑢?nèi)毛細胞帶狀突觸的可塑性進行研究，是對感音神經(jīng)性聾致病機理的新的補充，具有廣泛的研究前景和應用前景。

9、 材料和方法： 本實驗選用C57小鼠120只(由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，除外耳和中耳疾病，2月齡，體重25±1.23 g。使用ABRs進行聽力評估，造模前聽力正常，造模后聽閾大于30dB。將小鼠隨機分為2部分。每部分分為6組，每組10只，對其中的5組使用100mg/kg慶大霉素進行腹腔注射，分別注射4d(4d組)、7d(7d組)、10d(10d組)、14d(14d組)、21d(21d組)，另1組為正常對照組(0d組

10、)。分離小鼠耳蝸基底膜，一部分對耳蝸基底膜進行免疫熒光雙標記，使用激光共聚焦顯微鏡對基底膜進行序列掃描，并對所采得的序列掃描圖像利用3ds max8進行三維重建，進而分析內(nèi)毛細胞帶狀突觸的數(shù)量；另一部分使用免疫熒光方法檢測內(nèi)毛細胞帶狀突觸囊泡中otoferlin的表達，采用western blotting對otoferlin的表達進行半定量分析。 結果： 一、對正常組耳蝸基底膜頂回的10個序列掃描中的內(nèi)毛細胞帶狀突觸進行

11、三維建模并計數(shù)，得出每個內(nèi)毛細胞的帶狀突觸數(shù)量為X±SD=16.10±1.032。 一、使用3d max8.0軟件對各組中內(nèi)毛細胞帶狀突觸數(shù)量進行分析，每組中每個內(nèi)毛細胞所含的帶狀突觸數(shù)量的數(shù)量以X±SD表示，帶狀突觸在慶大霉素腹腔注射第7d時數(shù)量最多，6組中每個內(nèi)毛細胞包含的帶狀突觸數(shù)量差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.01)。7d組中每個內(nèi)毛細胞包含的帶狀突觸數(shù)量顯著多于其它5組。 三、使用免疫熒光方法，F(xiàn)ITC標記的ot

12、oferlin呈綠色，位于內(nèi)毛細胞底部，外毛細胞僅有纖毛非特異性著色。利用Western blotting檢測otoferlin的表達：在140.5kD左右的位置檢測到otoferlin的表達，并對其進行半定量分析。注射慶大霉素前otoferlin表達量較少，在注射第4d時表達量增加，第7d時表達量最多。各時間點otoferlin蛋白表達吸光度比值組間差異顯著(P<0.01)。 結論： 一、在耳蝸基底膜鋪片中，由于帶狀突

13、觸并非存在于同一平面，為了對內(nèi)毛細胞帶狀突觸進行數(shù)量分析，使用免疫熒光雙標對突觸結構蛋白及突觸后的受體蛋白進行標記，結合激光共聚焦顯微鏡序列掃描，最后使用3d max8.0進行三維重建，可以得到內(nèi)毛細胞帶狀突觸的準確數(shù)量。 二、在慶大霉素作用早期，內(nèi)毛細胞的數(shù)量未發(fā)生改變時，內(nèi)毛細胞帶狀突觸的數(shù)量已經(jīng)發(fā)生變化。在慶大霉素腹腔注射的第7d，內(nèi)毛細胞帶狀突觸的數(shù)量達到高峰，之后又出現(xiàn)減少。內(nèi)毛細胞帶狀突觸通過數(shù)量的改變，增加或減少與

14、螺旋神經(jīng)元之間的神經(jīng)連接。對慶大霉素的耳毒性起到一定代償作用，但這一作用不足以維持正常聽閾。 三、在慶大霉素作用早期，內(nèi)毛細胞的數(shù)量未發(fā)生改變時，內(nèi)毛細胞帶狀突觸中otoferlin的表達已經(jīng)發(fā)生變化。在慶大霉素腹腔注射的第4d，內(nèi)毛細胞帶狀突觸中otoferlin的表達增加，于第7d達到高峰，之后表達下降。提示這種變化可能是帶狀突觸通過otoferlin表達的增強，增加了內(nèi)毛細胞帶狀突觸的囊泡融合和突觸遞質的釋放，在早期對慶大