新型促紅素衍生肽對(duì)小鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：在小鼠腎臟缺血再灌注(Ischemia Reperfusion，I/R)損傷模型中探究新型促紅細(xì)胞生成素B螺旋表面肽(Helix B surface peptide，HBSP)對(duì)腎功能及組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，并明確組織保護(hù)性β共同受體(Beta Common Receptor，βcR)亞單位在腎臟局部的表達(dá)分布及其在缺血再灌注損傷中的變化，進(jìn)一步探討HBSP對(duì)凋亡通路蛋白caspase-9及caspase-3活化的影響，并研究細(xì)胞內(nèi)

2、抗凋亡信號(hào)通路PI3K/Akt在其中的作用，闡明HBSP的腎臟保護(hù)機(jī)制，為其臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。
　　 方法：選擇20-25g雄性BALB/c小鼠24只，隨機(jī)分為I/R組6只(I/R)，HBSP組6只(HBSP)，HBSP+Wortamannin組6只(H+W，wortmannin為PI3K通路抑制劑)，假手術(shù)組6只(sham)。建立雙側(cè)腎蒂夾閉30min模型，假手術(shù)組僅游離雙側(cè)。腎蒂而不行結(jié)扎。根據(jù)參考文獻(xiàn)，HBSP組于手術(shù)

3、后1min、6h、12h給予腹腔注射HBSP，劑量8nmol/kg，H+W組于術(shù)前30min腹腔注射wortmannin，劑量1mg/kg，I/R組及sham組均腹腔給予等量生理鹽水。各組于缺血再灌注后48h取心臟血測(cè)腎功能指標(biāo)(血肌酐、尿素氮)，同時(shí)取腎臟標(biāo)本制作石蠟切片行HE及TUNEL染色，進(jìn)一步觀察組織病理改變及調(diào)亡水平。應(yīng)用免疫組化技術(shù)分別檢測(cè)I/R組及sham組腎臟受體亞單位βcR和促紅素受體亞單位(erythropoiet

4、in receptor，EPOR)的分布及表達(dá)情況，并應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)各組腎組織中功能性βcR/EPOR異二聚體的表達(dá)水平。應(yīng)用western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組及wortmannin組小鼠腎組織中PI3K p85、總Akt以及磷酸化Akt的表達(dá)水平。應(yīng)用免疫組化檢測(cè)各組腎組織切片中活化型caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)一步應(yīng)用western blot檢測(cè)各組腎組織中49kD全長(zhǎng)型caspase-9、37/39kD活化

5、型capsase-9及17kD活化型caspase-3的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：HBSP組術(shù)后血肌酐和尿素氮水平顯著低于I/R組(23.83±1.32 vs。119.80±6.41μmol/L，P<0.01；10.62±0.79 vs.50.33±5.09mmol/L，P<0.01)。光鏡下HE染色切片可見HBSP組腎臟損傷程度與I/R組相比明顯減輕，小球結(jié)構(gòu)基本清楚，小管上皮細(xì)胞輕度水腫，基底膜較完整，小管內(nèi)少量管型，腎小管損

6、傷病理評(píng)分明顯降低(1.17±0.31 vs.4.50±0.43，p<0.01)。TUNEL染色可見HBSP組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于I/R組，半定量結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(3.83±1.40 vs。24.17±1.45，p<0.05)。組織保護(hù)受體的亞單位βcR和EPOR主要組成性表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，并在缺血再灌注損傷后明顯上調(diào)(94.83±4.19 vs。130.70±13.80，p<0.05；184.30±6.97 vs.246.5±15

7、.43，p<0.01)，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)βcR/EPOR異二聚受體在腎組織中組成性表達(dá)，且缺血再灌注損傷對(duì)其亦有顯著的刺激作用(與EPOR共沉淀的βcR/GAPDH，0.47±0.12 vs.0.95±0.12，p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組腎組織中PI3K p85表達(dá)水平無(wú)明顯差異。HBSP組腎臟中總Akt表達(dá)水平以及磷酸化蛋白p-Akt-ser473和p-Akt-th308表達(dá)水平均較I/R組明顯升高(/β-actin，0.44±0.042

8、vs.0.21±0.04，p<0.05；2.09±0.55 vs.0.13±0.01，p<0.05；0.77±0.12 vs.0.12±0.06，p<0.01)。wortmannin對(duì)PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)，包括PI3K p85、Akt及其磷酸化蛋白具有普遍的抑制作用(/β-actin，0.07±0.04 vs。0.44±0.04，p<0.05；0.05±0.01 vs.2.09±0.55，p<0.05；0.01±0.00 vs.

9、0.77±0.12，p<0.01)。HBSP組腎臟中caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯少于I/R組(1.33±0.42 vs。8.67±0.67，p<0.01)，而PI3K/Akt通路抑制劑wortmannin能明顯逆轉(zhuǎn)HBSP的作用(15.67±1.98 vs.1.33±0.42，p<0.01)。各組腎組織中49kD全長(zhǎng)型Caspase-9表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而HBSP組39kD、37kD活化型片段及caspase-3的17kD活化型片

10、段均較IR組顯著降低(/β-actin，0.60±0.07 vs.1.55±0.32，p<0.05；0.05±0.01 vs.0.89±0.31，p<0.05；0.08±0.03 vs.0.26±0.04，p<0.05)，wortmannin亦明顯逆轉(zhuǎn)HBSP對(duì)上述caspase-9及caspase-3活化片段的抑制作用(/β-actin，2.95±0.58 vs.0.60±0.07，p<0.05；2.01±0.17 vs.0.05±0

11、.01，p<0.01；1.85±0.62 vs.0.08±0.03，p<0.05)。
　　 結(jié)論：新型促紅細(xì)胞生成素衍生肽HBSP能顯著減輕腎臟缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞損傷程度和凋亡水平，具有良好的腎臟保護(hù)作用。組織保護(hù)性受體βcR/EPOR組成性表達(dá)于腎臟中，并在缺血再灌注損傷中上調(diào)表達(dá)，是HBSP腎臟保護(hù)作用的基礎(chǔ)。HBSP通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白表達(dá)及磷酸化水平，活化PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制凋亡蛋白caspas