金絲猴源糞腸球菌dlt7a發(fā)酵工藝及其制劑對宿主腸道菌群的影響.pdf

1、神農(nóng)架金絲猴屬川金絲猴的亞種，是我國特有的瀕危保護(hù)物種。由腸道菌群失調(diào)引起的各類消化道問題嚴(yán)重影響著神農(nóng)架金絲猴的健康和繁育。近年來，通過飲食添加益生菌來調(diào)節(jié)宿主腸道微生態(tài)平衡，達(dá)到預(yù)防以及治療某些消化道疾病的目的，已成為一種公認(rèn)的有效方法。而國內(nèi)外關(guān)于金絲猴微生態(tài)制劑的研究很少。本課題組前期已從健康野生的神農(nóng)架金絲猴糞便中分離鑒定出益生糞腸球菌dlt7a，具有良好的安全性和可生產(chǎn)性。本研究優(yōu)化了糞腸球菌dlt7a的發(fā)酵工藝，制備神農(nóng)架

2、金絲猴專用的益生菌制劑;給神農(nóng)架金絲猴的日糧添加糞腸球菌dlt7a制劑，通過宏基因組測序的方法，探討糞腸球菌dlt7a對神農(nóng)架金絲猴腸道菌群的影響，以期為制定神農(nóng)架金絲猴的健康調(diào)節(jié)技術(shù)提供理論依據(jù)。
　　試驗(yàn)一糞腸球菌dlt7a發(fā)酵工藝優(yōu)化
　　本試驗(yàn)測定了dlt7a在不同種子培養(yǎng)基中的活菌數(shù)和種子培養(yǎng)基中的生長曲線，分別研究了不同裝液量、接種量、初始pH值對發(fā)酵液中dlt7a增殖的影響。結(jié)果表明dlt7a最適的種子培養(yǎng)基是

3、MRS肉湯，接種培養(yǎng)10h的種子液最適宜接種發(fā)酵液，最佳裝液量為20％，最佳接種量為2％，最適初始pH為6.5。
　　利用PB試驗(yàn)篩選得出蔗糖、魚粉和KH2PO4是影響發(fā)酵液中活菌數(shù)的重要因素，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)，對這3個(gè)因素在發(fā)酵液中的最佳濃度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基是:蔗糖2.55％，魚粉2.63％，豆粕2.50％，酵母膏0.40％，CaCO31.00％，KCl0.10％，MgSO4·7H2O0.10％，KH2PO

4、40.014％。在優(yōu)化后發(fā)酵工藝下培養(yǎng)dlt7a菌株，活菌數(shù)可達(dá)58.83×108CFU/mL，比優(yōu)化前提高了46.53％，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
　　試驗(yàn)二糞腸球菌dlt7a對神農(nóng)架金絲猴腸道菌群的影響
　　本研究選取神農(nóng)架金絲猴人工繁育基地的4只籠養(yǎng)金絲猴，進(jìn)行周期為28d的金絲猴飼喂試驗(yàn)，每天分3次給金絲猴日糧添加糞腸球菌dlt7a益生菌制劑，分別采集在試驗(yàn)前(Day0)、試驗(yàn)期間(Day14)和試驗(yàn)后(Day28)每

5、只金絲猴一一對應(yīng)的糞便樣品，提取12份糞便樣品的基因組，用于宏基因組測序，生物信息分析了神農(nóng)架金絲猴腸道菌群的結(jié)構(gòu)及其功能的信息，并對不同試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)菌群及其功能的基因豐度進(jìn)行差異比較分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.對腸道菌群進(jìn)行物種注釋，研究結(jié)果顯示:給神農(nóng)架金絲猴日糧添加糞腸球菌dlt7a沒有顯著改變腸道菌群的多樣性;金絲猴腸道菌群中優(yōu)勢菌門是厚壁菌門(40.27％)和擬桿菌門(33.60％)，飼喂糞腸球菌dlt7a后，厚壁菌

6、門的相對豐度減少而擬桿菌門的相對豐度增加;在試驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)，金絲猴腸道菌群的優(yōu)勢菌屬均為Bacteroides、Prevotella、Treponema和Ruminococcus，但糞腸球菌dlt7a使腸道菌群中Parabacteroides相對豐度顯著增加(P＜0.05)，Bacteroides、Fibrobacter和Roseburia相對豐度分別增加5.35％、1.66％、1.33％;在種水平上，糞腸球菌dlt7a引起腸道菌群Pr

7、evotella_copri(2.16％)、Fibrobacter_succinogenes(1.66％)、Bacteroidales_bacterium(1.61％)、Eubacterium_rectale(1.11％)和Bacteroides_sp.(0.84％)的相對豐度增加，而Prevotella_ multisaccharivorax(1.25％)、Cetobacterium_ somerae(0.66％)、Chthoniob

8、acter_flavus(0.36％,P＜0.05)、Verrucomicrobia_bacterium(0.32％)和Pedosphaera_parvula(0.32％)相對豐度減少。結(jié)果表明，給神農(nóng)架金絲猴日糧添加糞腸球菌dlt7a對金絲猴腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，可以增加分解多糖等有益菌群的相對豐度，有利于金絲猴的生長及免疫。
　　2.將預(yù)測的基因與碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，分析結(jié)果顯示:Day28與Day0相比，GH

9、77、GH117、GH55、GT14相關(guān)基因的相對豐度顯著增加(P＜0.05)，CBM51和GH110相關(guān)基因的相對豐度顯著減少(P＜0.05);在試驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)，與GT2、GH13、GH3、GH43相關(guān)基因豐度一直較高，且在Day28明顯高于Day0。結(jié)果表明，給神農(nóng)架金絲猴日糧添加糞腸球菌dlt7a可以增加某些糖苷水解酶類的基因豐度，加強(qiáng)腸道菌群消化多糖的能力，為宿主腸上皮細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)。
　　3.將預(yù)測的基因與KEGG通路

10、數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。結(jié)果顯示:Day28與Day0相比，有12個(gè)功能類變化顯著(P＜0.05)，其中相關(guān)基因豐度增加的通路包括Alanine,aspartate and glutamate metabolism（丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝）、Tyrosinemetabolism（酪氨酸代謝）、Arginine and proline metabolism（精氨酸和脯氨酸代謝）、Valine，leucine and isoleucine b

11、iosynthesis（纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸生物合成）、Valine，leucine and isoleucine degradation（纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解）、Tryptophan metabolism（色氨酸代謝）、Oxidative phosphorylation（氧化磷酸化）、Glyoxylate and dicarboxylate metabolism（乙醛酸和二元羧酸鹽代謝）、Ethylbenzenedegr