下調(diào)端粒酶活性對乳腺癌生物學(xué)特性影響的實驗研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的常見的惡性腫瘤之一，中國女性乳腺癌的發(fā)病率與世界多數(shù)發(fā)達國家相比雖然較低，但從20世紀(jì)末到21世紀(jì)初的短短20年里，該病發(fā)病率已急速上升，而且發(fā)病年齡也逐漸年輕化，使得這一疾病的危害更加顯著。半個世紀(jì)以來，傳統(tǒng)的乳腺癌治療發(fā)生了劃時代的變化，由單純手術(shù)治療轉(zhuǎn)變?yōu)橐酝饪剖中g(shù)為主，聯(lián)合放療、化療、內(nèi)分泌治療等的綜合治療。盡管人們對乳腺癌的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移的機理等生物學(xué)特性方面做了深入的研究，取得了較大的進步，但是，

2、乳腺癌患者的死亡率仍徘徊在20/10萬左右。研究其侵襲及轉(zhuǎn)移的機理等生物學(xué)特性，以及利用分子生物學(xué)技術(shù)，阻斷腫瘤細胞侵襲、浸潤和轉(zhuǎn)移的靶點，已成為當(dāng)前研究的熱點之一。
　　 RNA干涉(RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象，它是由dsRNA介導(dǎo)的、Dicer酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平上特異性阻斷目的基因的表達。端粒酶(telomerase)是由一個互補于端粒DNA

3、的RNA亞基和具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的端粒酶催化亞基(TERT)及相關(guān)蛋白組成。端粒酶活性的表達與細胞衰老和某些疾病，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。TERT被普遍認(rèn)為是端粒酶的催化亞基，其基因的表達與端粒酶的激活密切相關(guān)。端粒酶特異性高表達于包括乳腺癌在內(nèi)的絕大部分惡性腫瘤，而絕大多數(shù)正常組織幾乎不表達的特性使之成為腫瘤治療的優(yōu)選靶點。通過特異性下調(diào)TERT基因表達改變腫瘤細胞端粒酶活性，伴隨端粒酶活性改變，腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)

4、特性隨之改變。
　　 端粒酶在乳腺癌細胞中的表達如何？端粒酶活性與乳腺癌細胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性關(guān)系如何？下調(diào)端粒酶活性對乳腺癌上述生物學(xué)活性的影響如何？為回答上述相關(guān)問題，本研究擬利用RNAi技術(shù)，設(shè)計針對hTERT基因mRNA特異性短發(fā)夾干擾片段，利用分子克隆技術(shù)，重組pSUPER_retro_puro質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7、MDA-MB231細胞系，建立端粒酶活性下調(diào)的乳腺癌細胞系，檢測轉(zhuǎn)染前后細胞

5、端粒酶活性變化，通過MTT法、軟瓊脂集落形成形成實驗等對細胞增殖；劃痕實驗對細胞遷移；Transwell實驗對細胞侵襲能力；以及轉(zhuǎn)染后細胞對電離輻射、化療藥物作用的敏感性等進行研究，探討下調(diào)端粒酶活性對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及對放化療敏感性的影響，初步探討端粒酶為靶點的乳腺癌基因治療結(jié)合傳統(tǒng)腫瘤治療方法的效應(yīng)等相關(guān)問題。
　　 材料和方法:
　　 1、靶向hTERT基因mRNA的shRNA質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建
　

6、　 設(shè)計并采用化學(xué)合成法合成靶向hTERT基因mRNA序列的短發(fā)夾寡核苷酸序列，經(jīng)退火后連接到線性化pSUPER_retro_puro質(zhì)粒BgIII和HND III酶切位點之間，構(gòu)建hTERT shRNA表達質(zhì)粒載體pSUPER_retro_puro-TERT-RNAi＃1、＃2(pSUPER-TERT-RNAi＃1、＃2)，經(jīng)EcoRI和HINDIII雙酶切電泳分析及插入基因片段序列分析，驗證插入目的基因片段位置及序列正確性。

7、>　　 2、穩(wěn)定表達細胞系建立和轉(zhuǎn)染前后細胞端粒酶活性及hTERT基因mRNA水平和蛋白水平變化
　　 采用磷酸鈣法將擴增純化后的pSUPER-TERT-RNAi＃1、＃2重組質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染組)及pSUPER_retro_puro質(zhì)粒(陰性對照組)分別轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-231細胞系，經(jīng)puromycin藥物篩選，建立穩(wěn)定表達的陽性細胞克隆。采用Trizol法收集細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計hTERT mRN

8、A引物，選取GAPDH為內(nèi)參對照，RT-PCR檢測mRNA水平；收集各組細胞總蛋白，選取α-tubulin為內(nèi)參對照，Western blotting檢測各組細胞端粒酶蛋白表達，TRAP-ELISA方法檢測細胞端粒酶活性，與陰性對照組及未經(jīng)處理的MCF-7和MDA-MB231細胞系(空白對照組)比較各組間差異。
　　 3、端粒酶活性下調(diào)對乳腺癌細胞系增殖、遷移及侵襲能力的影響
　　 采用MTT法、瓊脂糖凝膠克隆形成檢測轉(zhuǎn)

9、染前后乳腺癌細胞增殖活性，劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細胞遷移能力，同時利用Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細胞的侵襲能力等的變化，評價端粒酶活性下調(diào)后對乳腺癌細胞系增殖、遷移及侵襲能力的影響。
　　 4、端粒酶活性下調(diào)對乳腺癌細胞電離輻射、化療藥物敏感性的影響
　　 選取常用化療藥物阿霉素經(jīng)稀釋后加入各組細胞培養(yǎng)液中或利用UV-crosslink對各組細胞進行UV照射，經(jīng)一定時間培養(yǎng)后，利用MTT法對不同時間點各

10、組細胞增殖活性進行檢測，探討端粒酶活性下調(diào)對乳腺癌細胞放療、化療敏感性的影響。
　　 5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理分析
　　 細胞學(xué)實驗采用圖片說明，各組間差異通過軟件進行量化后應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包對量化數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，判別各組間差異的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、靶向hTERT基因mRNA的shRNA質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建
　　 重組構(gòu)建pSUPER- TERT-RNAi＃1、＃2經(jīng)E

11、coRI和HINDIH雙酶切電泳分析顯示目的片段成功插入正確位置；選取酶切正確重組質(zhì)?？寺∷托蛄袡z測分析結(jié)果表明合成序列成功插入預(yù)定位點，且序列與設(shè)計合成的完全一致。說明成功構(gòu)建hTERT shRNA表達質(zhì)粒載體。
　　 2、穩(wěn)定表達細胞系建立和轉(zhuǎn)染前后細胞端粒酶活性及hTERT基因mRNA水平和蛋白水平變化
　　 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組細胞經(jīng)puromycin藥物篩選兩周后，成功構(gòu)建陽性克隆。與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染組端粒酶

12、活性下調(diào)明顯，其中MCF-7細胞系RNAi＃1下調(diào)至50.88±13.41％，RNAi＃2組下調(diào)至35.45±6.20％，MDA-MB231細胞系RNAi＃1下調(diào)至49.47±7.1％，RNAi＃2組下調(diào)至42.40±8.37％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，陰性對照組端粒酶活性無明顯變化；與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染組細胞hTERT基因mRNA水平明顯下降，其中MCF-7細胞系RNAi＃1相對積分光密度為54.89±1.06％，RN Ai＃2組為49.

13、90±4.98％，空白對照組為99.18±6.62％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，陰性對照組為98.19±2.84％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MDA-MB231細胞系RNAi＃l組相對積分光密度為56.64±10.79％，RNAi＃2組為50.00±3.16％，空白對照組為101.85±4.34％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，陰性對照組為102.22±2.47％；空白對照組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3、下調(diào)端粒酶活性對乳腺癌細胞系增殖、遷移及

14、侵襲能力的影響
　　 MTT法檢測細胞增殖活性能力顯示，MCF-7及MDA-MB231轉(zhuǎn)染組細胞增殖活性較空白對照組低，并分別從第2天和第3天起，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。軟瓊脂集落形成實驗提示MCF-7和MDA-MB231轉(zhuǎn)染組細胞克隆形成能力較空白對照組分別下降58.37±1.85％和62.80±0.78％，劃痕實驗實驗顯示MCF-7細胞學(xué)轉(zhuǎn)染組細胞遷移能力減弱；Transwell實驗則證實MDA-MB231轉(zhuǎn)染組細胞侵襲能力較空白

15、對照組減弱54.96±4.03％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；上述實驗空白對照組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4、下調(diào)端粒酶活性對乳腺癌細胞接受電離輻射、化療藥物治療敏感性的影響
　　 通過阿霉素模擬化療藥物作用，UV照射模擬電離輻射實驗，并利用MTT法對不同時間點各組細胞增殖活性進行檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細胞較空白對照組細胞接受放、化療后細胞增殖活性持續(xù)明顯下降，并呈現(xiàn)不可逆性表現(xiàn)，對照組與空白對照組無明顯差異，說明端粒酶下調(diào)后

16、乳腺癌MCF-7和MDA-MB231細胞對電離輻射、化療藥物敏感性增加。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過RNAi技術(shù)特異性干擾hTERT基因mRNA表達可顯著下調(diào)細胞端粒酶活性；
　　 2、乳腺癌細胞端粒酶活性下調(diào)可導(dǎo)致細胞增殖活性、遷移及侵襲能力的下降；
　　 3、端粒酶活性下調(diào)后可增加乳腺癌細胞對電離輻射、化療藥物的敏感性；
　　 4、以端粒酶為靶點的基因治療聯(lián)合電離輻射、化療等可能是乳腺癌治療