新生大鼠HIBD遠(yuǎn)期神經(jīng)功能和超微結(jié)構(gòu)改變及早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)其影響的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景:
　　 新生兒缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)是指各種圍產(chǎn)期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷，臨床出現(xiàn)一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的表現(xiàn)，是引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一，將遺留諸多后遺癥，如腦性癱瘓、智力低下、癲癇及發(fā)育遲緩等。隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的建立和醫(yī)療技術(shù)水平的提高，許多中、重度缺氧缺血性腦損傷患兒得以生存，但

2、存活兒永久性腦功能障礙發(fā)病率仍較高。HIBD是一種彌漫性損傷，病變主要在大腦海馬、皮層、紋狀體、基底節(jié)、丘腦等部位，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，是由多種機(jī)制綜合作用所致的一系列生化連鎖反應(yīng)或稱缺氧缺血性瀑布的結(jié)果。目前臨床上對(duì)于新生兒HIBD治療多采用對(duì)癥處理、營(yíng)養(yǎng)支持及早期干預(yù)等綜合治療，尚缺乏特效、經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)治療新生兒HIBD，因此深入探究HIBD機(jī)制和修復(fù)機(jī)制，尋找有效的防治措施，對(duì)于提高新生兒HIBD存活率，減少存活兒遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，

3、提高我國(guó)人口質(zhì)量均有重要意義。
　　 新生兒處在大腦發(fā)育關(guān)鍵期，而且新生兒HIBD具有非進(jìn)行性、無(wú)持續(xù)性的缺血缺氧因素存在等特點(diǎn)，生后7dSD大鼠腦與新生兒腦發(fā)育相似，而且造成一過(guò)性腦缺氧缺血條件也與HIBD相似，因此，國(guó)內(nèi)外以生后7d新生SD大鼠為研究對(duì)象，參照Rice方法，建立新生鼠HIBD動(dòng)物模型，該模型被廣泛應(yīng)用于研究HIBD相關(guān)課題。在上述基礎(chǔ)上，利用動(dòng)物模型，深入探討HIBD后的損傷機(jī)制，了解缺氧缺血對(duì)新生大鼠遠(yuǎn)期神

4、經(jīng)功能和超微結(jié)構(gòu)的影響，探索合理、全面的判斷預(yù)后和評(píng)估療效的方法，進(jìn)一步尋求有效、經(jīng)濟(jì)的干預(yù)措施，并探討干預(yù)措施的修復(fù)機(jī)制。
　　 HIBD是一種彌漫性損傷，由于HIBD致病因素的復(fù)雜性，加上嬰幼兒腦發(fā)育的特殊性和可塑性，臨床上要準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)HIBD的遠(yuǎn)期預(yù)后及干預(yù)療效相當(dāng)困難，許多患兒的預(yù)后與急性期損傷的嚴(yán)重程度并無(wú)一致的線性相關(guān)。而目前關(guān)于HIBD動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)于HIBD遠(yuǎn)期預(yù)后及干預(yù)措施療效的評(píng)價(jià)多停留在行為學(xué)及上述兩個(gè)

5、腦區(qū)損傷后常規(guī)病理學(xué)改變的觀察上，鮮有超微結(jié)構(gòu)的研究。突觸是神經(jīng)元和效應(yīng)細(xì)胞之間傳遞信息的功能部位，與行為學(xué)表現(xiàn)之間關(guān)系密切，也是腦發(fā)育可塑性的核心。因此，觀察突觸超微結(jié)構(gòu)的改變不僅可以深入探究HIBD機(jī)理及修復(fù)機(jī)制，還可以了解其與行為學(xué)之間的相關(guān)性，從而有望對(duì)HIBD遠(yuǎn)期預(yù)后及干預(yù)療效做出早期客觀的評(píng)價(jià)。
　　 目前對(duì)于新生兒HIBD的治療措施主要有高壓氧、亞低溫、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物及一般支持對(duì)癥處理，高壓氧治療方法受醫(yī)院條件設(shè)備限

6、制、早期病情程度亦影響其應(yīng)用，且治療時(shí)間窗、療程尚無(wú)統(tǒng)一定論等，而亞低溫治療方法不僅療效不確定，而且應(yīng)用范圍較為局限，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物目前研究報(bào)道僅提示對(duì)疾病急性期有一定效果，且治療費(fèi)用高，影響其在臨床上的應(yīng)用。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是指通過(guò)病人自身力量或治療師的輔助操作或借助于器械所進(jìn)行的主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)動(dòng)以改善局部或全身功能為目的的一種治療方法。因其實(shí)施方便、費(fèi)用低、治療可長(zhǎng)期堅(jiān)持并可在家中實(shí)施，在臨床上已應(yīng)用于新生兒HIBD的治療，取得一定療效，但其具

7、體機(jī)制尚未完全明確。一方面因?yàn)樾律鷥捍竽X正處在發(fā)育關(guān)鍵期，存在著較強(qiáng)可塑性，對(duì)損傷有一定自身修復(fù)能力，臨床上很難判斷患兒的進(jìn)步是否與此干預(yù)治療相關(guān)。另外，研究表明，適時(shí)適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不僅能改善運(yùn)動(dòng)功能，而且可以提高人和動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。新生兒HIBD除運(yùn)動(dòng)功能障礙外，許多伴有智力低下、感覺(jué)統(tǒng)合失調(diào)等問(wèn)題，早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否也能改善患兒這些功能呢？是通過(guò)何種可能途徑改善的呢？
　　 據(jù)研究報(bào)道，適宜的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)

8、cAMP、Ca2+等第二信使適量增加，從而誘導(dǎo)c-fos基因表達(dá)，控制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而合成新的蛋白質(zhì)。在正常情況下，c-fos蛋白參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、信息傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等生理過(guò)程，它對(duì)于編碼記憶，形成大多數(shù)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（Long-termpotentiation，LTP）有著十分重要的作用，而LTP是神經(jīng)元可塑性的反映。因此，有利于大腦的記憶功能，這為運(yùn)動(dòng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的促進(jìn)作用在分子水平上提供一個(gè)證據(jù)。
　　 已有研究指出

9、突觸素(p38)是突觸重建的重要標(biāo)志，因?yàn)閜38參與神經(jīng)元發(fā)育和分化過(guò)程。發(fā)育中神經(jīng)元p38的表達(dá)優(yōu)先于突觸的構(gòu)成，即在突觸結(jié)構(gòu)形成之前就已經(jīng)有p38存在和表達(dá)，隨著神經(jīng)元發(fā)育成熟、突觸成熟，p38的表達(dá)也相應(yīng)增加。p38還直接參與了突觸的形成及調(diào)節(jié)與突觸相關(guān)的其它突觸蛋白的表達(dá)。因此該蛋白被廣泛用于標(biāo)記突觸終末。
　　 基于以上理論，本研究采用Rice方法建立新生大鼠HIBD模型，觀察大鼠遠(yuǎn)期行為學(xué)、病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變，探

10、索HIBD機(jī)制，重點(diǎn)觀察超微結(jié)構(gòu)的改變及其意義，指導(dǎo)HIBD遠(yuǎn)期預(yù)后及療效評(píng)估。之后早期給予運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)，觀察其對(duì)新生大鼠HIBD遠(yuǎn)期運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)記憶能力及感覺(jué)功能的療效，并利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)c-fos、突觸素的表達(dá)，來(lái)初步探索其療效機(jī)制。
　　 具體研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)部分:
　　 第一部分:構(gòu)建新生大鼠HIBD動(dòng)物模型，觀察遠(yuǎn)期行為學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變
　　 目的:
　　 建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷

11、（Hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD）模型，觀察遠(yuǎn)期行為學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變，提供HIBD遠(yuǎn)期功能評(píng)價(jià)方法及指導(dǎo)臨床治療。
　　 方法:
　　 60只7日齡新生SD大鼠隨機(jī)分為HIBD組和假手術(shù)組，每組30只。生后5周進(jìn)行Morris水迷宮及感覺(jué)功能測(cè)試;取腦組織切片行尼氏染色計(jì)數(shù)神經(jīng)元數(shù)目;取皮層、海馬行透射電鏡，觀察突觸結(jié)構(gòu)、測(cè)量突觸后致密區(qū)厚度及活性區(qū)長(zhǎng)度，并與行為學(xué)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析。

12、r>　　 結(jié)果:
　　 Morris水迷宮測(cè)試中，HIBD組大鼠尋找平臺(tái)潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組（P＜0.05）;HIBD組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)較假手術(shù)組少（P＜0.05）。HIBD組感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試結(jié)果明顯差于假手術(shù)組。尼氏染色提示HIBD組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少（P＜0.01）。電鏡顯示，HIBD組大鼠突觸數(shù)量減少，突觸后致密區(qū)厚度及活性區(qū)長(zhǎng)度變薄變短。HIBD組大鼠海馬突觸后致密區(qū)厚度與Morris水迷宮尋找平臺(tái)潛伏期時(shí)間呈負(fù)

13、相關(guān)（r=-0.861，P=0.006），與三項(xiàng)感覺(jué)功能評(píng)估得分之和呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.758，P=0.029)。
　　 結(jié)論:
　　 缺氧缺血可致新生鼠遠(yuǎn)期神經(jīng)元減少和超微結(jié)構(gòu)損傷，造成遠(yuǎn)期行為學(xué)功能障礙，超微結(jié)構(gòu)改變?cè)谝欢ǔ潭壬蟽?yōu)于病理觀察，有助于更好評(píng)估預(yù)后和評(píng)價(jià)療效，基于未成熟腦突觸的可塑性，在腦發(fā)育關(guān)鍵期指導(dǎo)臨床治療。
　　 第二部分:早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)新生大鼠HIBD遠(yuǎn)期神經(jīng)功能的影響
　　 目

14、的:
　　 探討早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷遠(yuǎn)期病理、超微結(jié)構(gòu)、神經(jīng)功能的影響。
　　 方法:
　　 90只7日齡SD大鼠隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)組、對(duì)照組和假手術(shù)組。運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組建立HIBD模型，運(yùn)動(dòng)組于HIBD后1周開(kāi)始每天給予抓握、旋轉(zhuǎn)、行走、平衡等訓(xùn)練。4周后檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、空間學(xué)習(xí)記憶和皮層感覺(jué)功能、透射電鏡觀察突觸和神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，HE染色觀察腦組織病理改變，尼氏染色計(jì)數(shù)神經(jīng)元數(shù)目，并檢測(cè)突

15、觸素、c-fos表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 運(yùn)動(dòng)組神經(jīng)功能評(píng)分、空間學(xué)習(xí)記憶、皮層感覺(jué)功能均優(yōu)于對(duì)照組，和假手術(shù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。透射電鏡下對(duì)照組大鼠海馬和皮層突觸損傷嚴(yán)重，神經(jīng)氈區(qū)突觸減少，突觸前膨大腫脹、輪廓不清晰，突觸小泡溶解空泡形成，PSD變薄、薄厚不均，而運(yùn)動(dòng)組未見(jiàn)明顯異常。HE染色提示對(duì)照組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，可見(jiàn)腫脹壞死細(xì)胞，運(yùn)動(dòng)組與假手術(shù)組比較未見(jiàn)明顯異常，尼氏染色提示對(duì)照組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，與