信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3及其靶基因Cyclin D1在喉癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，喉癌的發(fā)病率居于全身惡性腫瘤的第十一位。目前，手術(shù)和放射治療仍然是治療喉癌的主要手段；化學(xué)治療對局部控制率的提高和預(yù)后的改善作用尚需進(jìn)一步的研究。在過去的幾十年，隨著各種喉功能保留措施的應(yīng)用，喉全切除術(shù)的應(yīng)用正在逐漸減少，但是喉癌的生存率沒有大的提高。因此，進(jìn)一步研究喉癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其腫瘤標(biāo)志物及臨床意義，對于喉癌的預(yù)防、診斷、預(yù)后評價和化療藥物選擇將有重大的意義。

2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族(signal transducers and activators of transcription，STATs)于上世紀(jì)90年代在研究干擾素(IFN α和IFN γ)對細(xì)胞的作用機(jī)制時被發(fā)現(xiàn)，Stat3是STATs家族的重要成員。Stat3蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈潛伏狀態(tài)，通過酪氨酸磷酸化被激活，磷酸化Stat3形成同源或異源性二聚體，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，發(fā)揮促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的作用。在正常細(xì)胞，Stat3的激活是個短暫的過程，只

3、持續(xù)數(shù)分鐘至數(shù)小時。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Stat3在人體多種原發(fā)腫瘤和細(xì)胞系中均有激活，并被定義為癌基因。Stat3主要通過調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)來發(fā)揮作用，包括腫瘤細(xì)胞生存、生長、血管生成、侵襲和逃避免疫監(jiān)視等，其主要靶基因有Cyclin D1、Bcl-xL、c-Myc等。目前，頭頸部鱗癌癌變的具體機(jī)制還不十分清楚，關(guān)于喉癌組織中Stat3表達(dá)和激活情況及與下游靶基因Cycl in D1的關(guān)系，國內(nèi)外尚未見專題報道。 目的： 為

4、了明確喉癌組織中Stat3表達(dá)和激活情況、活化的Stat3與其靶基因Cyclin D1表達(dá)關(guān)系和活化的Stat3相關(guān)臨床病理因素。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 收集2005年1月至2005年6月之間中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科64例喉癌手術(shù)標(biāo)本。對照組：選取其中的12例喉全切除術(shù)標(biāo)本中，距離腫瘤邊緣>1.0cm的粘膜組織作為對照組。 二、實(shí)驗(yàn)方法 (一)RT-PCR檢測Stat3和Cycli

5、n D1 mRNA表達(dá)Trizol一步法提取總RNA。cDNA合成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增Stat3基因引物序列為：5’-GGCATTCGGAAAGTATTG-3’(上游)，5’-TCACCCACATTCACTCATT-3’(下游)，擴(kuò)增長度463bp； Cyclin D1基因引物序列為：5’-CCCACTCCTACGATACGC-3’(上游)，5’-AGCCTCCCAAACACCC-3’(下游)，擴(kuò)增長度378bp；β-actin引物序列為：

6、5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’(上游)，5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’(下游)，擴(kuò)增長度473bp。 (二)Western印跡檢測Stat3、p-Stat3和Cyclin D1蛋白表達(dá)取組織塊提取細(xì)胞總蛋白，10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印后用Stat3、p-Stat3、Cyclin D1和抗β-actin單克隆抗體孵育。加入用堿性磷酸酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，顯色后置于UVP-8000凝

7、膠成像儀成像。 (三)免疫組化檢測Stat3、p-Stat3和Cyclin D1蛋白表達(dá)采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接(SP)免疫組織化學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。 (四)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組均數(shù)比較時用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)；雙變量相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。 結(jié)果： 1、64例喉癌組織和12

8、例對照組織中均有Stat3 mRNA的表達(dá)。喉癌組織與對照組織中Stat3 mRNA表達(dá)值分別為69.49±10.78和33.24±2.89，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.518，P=0.000)。 2、Western印跡64例喉癌組織和12例對照組織中均有Stat3蛋白的表達(dá)，喉癌組織與對照組織中Stat3蛋白表達(dá)值分別為118.83±25.86和72.46±6.58，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.142，P=0

9、.000)。 3、免疫組化Stat3蛋白細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有著色；64例癌組織中陽性67.2％，其中弱陽性21.9％，中度陽性20.3％，強(qiáng)陽性25.0％；12例對照粘膜組織均為陰性；二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)義(x2=18.568，P=0.000)。 4、Western印跡64例喉癌組織和12例對照組織中均有p-Stat3蛋白的表達(dá)，喉癌組織與對照組織中p-Stat3蛋白表達(dá)值分別為61.89±18.80和13.65±2.6

10、2，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.821，P=0.000)。 5、免疫組化p-Stat3蛋白細(xì)胞核著色；64例癌組織中陽性48.4％，其中弱陽性23.4％，中度陽性17.2％，強(qiáng)陽性7.8％；12例對照粘膜組織均為陰性；二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.817，P=0.002)。 6、不同性別、年齡、組織分化程度、腫瘤主體部位p-Stat3蛋白水平無顯著性差異；臨床T1、T2病變的p-Stat3蛋白水平高于臨床

11、T3、T4病變。 7、64例喉癌組織和12例對照組織中均有Cyclin D1 mRNA的表達(dá)。喉癌組織與對照組織中Cyclin D1 mRNA表達(dá)值分別為73.67±17.16和31.43±3.31，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.454，P=0.000)。 8、Western印跡64例喉癌組織和12例對照組織中均有Cyclin D1蛋白的表達(dá)，Cyclin D1蛋白表達(dá)值分別為113.12±23.65和55.32±

12、7.55，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.343，P=0.000)。 9、免疫組化Cyclin D1蛋白細(xì)胞核著色；64例癌組織中陽性43.7％，其中弱陽性25.0％，中度陽性15.6％，強(qiáng)陽性3.1％；12例對照粘膜組織中陰性91.7％，弱陽性8.3％；二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.371，P=0.020)。 10、Cyclin D1 mRNA與p-Stat3蛋白正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.827，