鼠慢性左室肥厚及心衰時細胞信號傳導、細胞骨架及膜電流改變.pdf

1、目的: 盡管心肌肥大是心臟在一些生理和病理情況下為維持足夠的心臟收縮功能而采取的一種代償性的適應性反應，但其心肌增殖肥大的最終結(jié)果往往導致心衰，而后者明顯降低患者的生活質(zhì)量和增加死亡率。MAPK(絲分裂素激活蛋白激酶)、JAK/STAT(Janse激酶/信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子)通路是重要的細胞信號調(diào)節(jié)通路系列，涉及細胞增殖、生長、分化、運動、衰老和死亡等細胞程序，一些體內(nèi)外試驗也顯示了肥大心肌細胞中上述兩個系列通路的激活。細胞膜

2、鉀電流是主要的動作電位復極電流，其變化對心肌細胞的興奮性和收縮性有很大影響。細胞微管蛋白是主要的細胞骨架成份，在固定細胞器，轉(zhuǎn)導細胞信息的方面起重要作用，但同時決定細胞的粘滯性和僵硬度，后兩者對心肌細胞內(nèi)肌絲的滑動又很大影響。目前對心肌細胞肥大的發(fā)生機制研究較多，但對心臟從代償性肥大到心衰轉(zhuǎn)變機制的研究尚不充分，且結(jié)果也有一定的差異性。該實驗利用慢性升主動脈縮窄所致心肌肥大及心衰動物模型，研究細胞信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路、JAK/ST

3、AT通路及心肌內(nèi)微管蛋白β-tubulin、心肌細胞膜瞬時外向鉀電流(Ito)、延遲整流性鉀電流(IK)及其腎上腺素受體激動劑對二者的調(diào)控等在心肌肥大及向心衰轉(zhuǎn)變過程中的變化，為今后更深入地研究心衰的發(fā)生發(fā)展機制并產(chǎn)生有效的干預治療提供實驗基礎。 材料和方法: 1.升主動脈縮窄動物模型的建立及動物分組：3～4周齡、體重為80～100g的雌性wistar大鼠，戊巴比妥鈉腹腔麻醉，上小動物呼吸機，開胸，剝離升主動脈，主動脈根

4、上方用絲線穿無菌聚乙烯塑料管(直徑1mm，長度6～7mm)環(huán)扎，負壓關(guān)胸。將16周升主動脈縮窄組大鼠定為代償性肥厚組，32周升主動脈縮窄組大鼠定為失代償性心衰組；各縮窄對照組為同期開胸分離升主動脈不縮窄組。 2.心臟超聲心動圖學監(jiān)測：大鼠術(shù)后行心臟超聲心動圖監(jiān)測，用HP5500型超聲診斷儀，探頭頻率2～4MHz。胸前放置水囊，取胸骨旁左室長軸和短軸切面。由二維超聲引導M型曲線并進行測量。超聲測定指標：1)左室后壁和室間隔舒張末期

5、厚度(PWD、IVS)；2)左室舒、縮末內(nèi)徑(LVDD、LVSD)；左室射血分數(shù)(EF％)。 3.蛋白質(zhì)印跡法測ERKs、JAKs、STATs、SOCSs、βTubulin表達水平：術(shù)后16周、32周時，各組大鼠分別行心臟超聲檢測結(jié)束后，稱體重，迅速取心臟，PBS冰浴清洗，留取左室部分，稱重后立即液氮冷凍，-80℃保存。留存各組大鼠的肺組織，稱重。將心肌組織剪碎，加入細胞裂解液，冰浴下勻漿、10,000g離心，留上清，調(diào)蛋白質(zhì)濃

6、度為2mg/ml，用于ERKs、JAKs等信號蛋白質(zhì)的定量。將心肌組織剪碎，加入微管穩(wěn)定液勻漿，100,000g離心，上清為游離β-tubulin成分，留置；沉淀重新懸浮在微管解聚液中1h，100,000g離心，上清為聚合β-tubulin，留置。取等量上述蛋白質(zhì)溶液，12％SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入1：200～500稀釋的一抗(兔抗ERK1/2或小鼠抗p-ERK1/2多克隆抗體，抗JAK1、JAK2、STAT1、STA

7、T3多克隆抗體、抗pTyr(1022/1023)-JAK1、抗pTyr(1007/1008)-JAK2、抗pTyr(701)-STAT1和抗pTyr(704)-STAT3、抗SOCS1、抗SOCS3、小鼠抗β-tubulin多克隆抗體)雜交過夜。封閉漂洗后加入1：5000稀釋的二抗(HRP標記的羊抗兔IgG抗體)，化學發(fā)光增強，X光壓片曝光，漂洗后自顯影。用密度掃描儀測定條帶的密度(OD值)，以積分光密度代表各種蛋白的相對表達值。

8、 4.心肌細胞的分離：各實驗組大鼠麻醉稱重后，開胸取心臟，稱重，主動脈逆行插管，改良Langendorff管灌流。先用臺氏液沖洗，再用無鈣臺氏液使心臟停跳，然后用含膠原酶的無鈣臺氏液灌流，KB液沖洗殘留的酶液，留用左室游離壁中層心肌組織并剪碎，攪拌后篩網(wǎng)過濾，離心清洗，KB液中留存，桿狀、有清晰橫紋的心肌細胞用于膜電流測定。 5.膜片鉗全細胞記錄技術(shù)：利用全細胞膜片鉗制技術(shù)記錄鉀電流，使用膜片鉗放大器。尖端膜片電極對心肌細胞進

9、行千兆封接。全細胞狀態(tài)形成后，用pCLAMP5.5.1軟件程序發(fā)放刺激并收集記錄信號。電流記錄采用電壓鉗制式。所有鉀電流密度經(jīng)膜電容標準化處理后進行比較，每一鉗制電壓下的電流強度繪制成電流電壓曲線。 6.統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用成對t檢驗和單因素方差分析方法。 結(jié)果: 1.心臟超聲心動學檢測：16周縮窄組大鼠與對照組相比較，PWD、IVS明顯增厚。LV

10、DD、LVSD、SV及EF％無明顯變化。32周縮窄組大鼠與對照組及16周縮窄組大鼠比較，LVDD、LVSD明顯增加，EF％明顯降低，PWD、IVS較正常對照組增厚，但較16周縮窄組大鼠無明顯變化。提示，16周縮窄組大鼠出現(xiàn)心肌肥厚，但心功能正常；32周縮窄組大鼠在心肌肥大的基礎上出現(xiàn)心腔擴大、心功能降低。 2.各組大鼠尸檢參數(shù)：16周縮窄組大鼠心重/體重比值明顯高于對照組，肺重/體重比值無變化。32周縮窄組大鼠心重/體重比值明顯

11、高于對照組及16周縮窄組，肺重/體重比值較對照組及術(shù)后16周大鼠明顯增加。提示，16周縮窄組大鼠出現(xiàn)心肌肥大，但心功能正常；32周縮窄組在心肌肥大的基礎上又出現(xiàn)左心衰竭。 3.各組大鼠心肌組織蛋白印跡檢驗結(jié)果 3.1 各組大鼠左室肌ERK、p-ERK1/2的表達：16、32周縮窄組大鼠與相應對照組比較，ERK1、ERK2、p-ERK1、p-ERK2表達量均明顯增高。32周縮窄組大鼠與16周縮窄組大鼠比較，ERK1、ERK

12、2的表達無明顯變化，但p-ERK1、p-ERK2明顯降低。p-ERK與心肌肥大的程度(心重/體重比值)呈正相關(guān)。 3.2 JAK/STAT及SOCS的表達及活性：16周縮窄組大鼠與對照組相比，JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、SOCS3的蛋白表達量均不同程度的增加，但SOCS1無明顯變化。32周縮窄組大鼠與對照組相比，JAK1、p-STAT1無明顯變化，而p-

13、JAK1、p-STAT3明顯降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3明顯增加。32周縮窄組大鼠與16周縮窄組比較，JAK2、STAT1、SOCS3無明顯變化，JAK1、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、STAT3、p-STAT3明顯降低，SOCS1明顯升高。 3.3 β-tubulin的蛋白表達：16、32周縮窄組大鼠與相應對照組比較，游離型及聚合β-tubulin均明顯升高，但聚合

14、型升高比例明顯高于游離型，聚合型與游離型β-tubulin表達量之比明顯增高，且上述變化在32周縮窄組更顯著。聚合型β-tubulin的蛋白表達量與大鼠心重/體重比值及肺重/體重比值呈正相關(guān)，與心臟左室射血分數(shù)呈負相關(guān)。 4.各組大鼠Ito及IK密度變化及腎上腺素受體激動劑對二者的影響：各組大鼠心肌細胞Ito、IK激活電壓均在-40mV，電流密度-電壓(Ⅰ-Ⅴ)均呈線性關(guān)系。16、32周縮窄組大鼠與相應對照組比較，Ito、IK密

15、度均明顯降低，在32周縮窄組大鼠，Ito降低更明顯。32周縮窄組大鼠與16周縮窄組大鼠相比較，Ito密度又有所降低，IK密度無明顯差別。苯福林、異丙腎上腺素均能使正常及16周縮窄組大鼠Ito、IK電流密度降低，且呈濃度依賴性，但苯福林對16周縮窄組大鼠IK降低的程度及異丙腎上腺素對16周縮窄組大鼠Ito降低的程度要明顯低于正常心肌細胞。苯福林、異丙腎上腺素對32周縮窄組大鼠的Ito及IK均無明顯影響。 結(jié)論: 1.在代償

16、性心肌肥大階段，心肌細胞信號傳導MAPK通路中的總ERK1/2蛋白合成量及其活化程度均明顯增加；在心衰期，ERK1/2活化程度較代償性心臟肥大階段明顯下降。 2.在代償性心臟肥大階段，JAK/STAT通路中的總JAKs、STATs蛋白合成量及其磷酸化狀態(tài)、內(nèi)源性抑制因子SCOS3較正常均明顯增高；在心衰期，JAKs、STATs的磷酸化狀態(tài)較代償性心臟肥大期明顯下降，SCOS1明顯增加。 3.微管蛋白β-tubulin游離