地氟醚預(yù)處理調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞NF-kB振蕩.pdf

1、第一部分地氟醚預(yù)處理對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用
　　目的:分離培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)，研究地氟醚預(yù)處理對HUVECs缺氧/復(fù)氧損傷所起的保護(hù)作用。
　　方法:采用膠原酶灌注消化法分離培養(yǎng)HUVECs，以Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光方法進(jìn)行鑒定。將細(xì)胞分為三組:對照組（CON組），缺氧/復(fù)氧組(A/R組)和地氟醚預(yù)處理組（De

2、sPC組），DesPC組在缺氧/復(fù)氧損傷前先給予30分鐘1MAC地氟醚處理。用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的重組膜粘連蛋白-5(AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶(PI)標(biāo)記，流式細(xì)胞儀計數(shù)凋亡細(xì)胞，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細(xì)胞存活率，采用WST-1(water-soluble tetrazolium salt)法測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活力。
　　結(jié)果:原代HUVECs生長5-7天后呈單層鋪路石樣排列，細(xì)胞為扁平多角形

3、，Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測為陽性。A/R組細(xì)胞凋亡率（35.73±5.43％，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）與CON組(23.62±4.56％)相比明顯增加，經(jīng)過地氟醚預(yù)處理后，DesPC組細(xì)胞凋亡(27.39±3.22％)較A/R組明顯下降。DesPC組細(xì)胞存活率(96.58±6.25％)明顯高于A/R組(86.25±3.61％)。A/R組細(xì)胞內(nèi)SOD活力(23.55±7.84U/mgprotein)較CON組(38.86±6.40U/mgprotein)

4、降低，DesPC組SOD活力(35.49±9.36U/mgprotein)與A/R組相比明顯增加。
　　結(jié)論:本實驗成功培養(yǎng)出原代HUVECs，建立了體外缺氧/復(fù)氧模型。地氟醚預(yù)處理抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧引起的細(xì)胞凋亡，保存細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性，從而具有一定的抗缺氧/復(fù)氧損傷效應(yīng)。
　　第二部分地氟醚預(yù)處理引起臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB振蕩和抗凋亡蛋白產(chǎn)生
　　目的:轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與調(diào)節(jié)吸入麻醉藥

5、物預(yù)處理引起的缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)作用。探討地氟醚預(yù)處理對HUVECs NF-κ B以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以明確地氟醚預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)機(jī)制。
　　方法:選用原代培養(yǎng)的HUVECs，將細(xì)胞分成6組:對照組(CON組)，地氟醚組（DES組），缺氧/復(fù)氧組(A/R組)，地氟醚預(yù)處理組（DesPC組），BAY+DesPC組和BAY+A/R組，DesPC在A/R前給予30分鐘1MAC地氟醚處理，DES組給予地氟醚處理但不經(jīng)歷

6、A/R損傷，BAY+DesPC組和BAY+A/R組分別在氣體處理前給予抑制劑BAY11-7082。利用annexinⅤ-FITC標(biāo)記，流式細(xì)胞儀計數(shù)凋亡細(xì)胞以及MTT法測定細(xì)胞存活率。免疫熒光方法標(biāo)記NF-κ B p65核轉(zhuǎn)運(yùn)，Western blot方法測細(xì)胞凋亡抑制蛋白1(c-IAP1)、B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)、天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）、NF-kappa B抑制因子ⅠκBα和磷酸化NF-κ

7、B p65(p-p65)的表達(dá)量。
　　結(jié)果:免疫熒光方法顯示，對照組NF-κ B p65免疫熒光標(biāo)記主要分布在胞漿區(qū)，DES組細(xì)胞在地氟醚處理結(jié)束后立即出現(xiàn)NF-κ B p65入核轉(zhuǎn)運(yùn)。Westernblot方法檢測DES組ⅠκBα含量較對照組下降，磷酸化NF-κ B p65增加，A/R組與對照組相比磷酸化NF-κ B p65顯著增加。DesPC組經(jīng)過地氟醚預(yù)處理的細(xì)胞ⅠκBα含量較A/R組增加，NF-κ B p65磷酸化減少，

8、同時c-IAP1、Bcl-2蛋白和caspase-3前體的蛋白含量也明顯增加。BAY+DesPC組和BAY+A/R組細(xì)胞存活率、凋亡率無明顯差異，細(xì)胞內(nèi)ⅠκBα含量、NF-κ B p65磷酸化和caspase-3前體含量均無明顯差異。
　　結(jié)論:實驗結(jié)果顯示地氟醚在預(yù)處理階段激活NF-κB并且通過負(fù)反饋抑制復(fù)氧階段NF-κ B的過度激活。地氟醚引起的NF-κ B的振蕩最終上調(diào)了內(nèi)皮細(xì)胞中抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而產(chǎn)生對抗A/R損傷的保