十二指腸鉤蟲(chóng)蛋白酶抑制劑Ad-KPI-2、Ad-API-1的克隆及其表達(dá)研究.pdf

1、[目的]
　　 在實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得十二指腸鉤蟲(chóng) Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑Ad-KPI-2(Genebank登錄號(hào):EF495070)及天冬氨酸蛋白酶抑制劑Ad-API-1(Genebank登錄號(hào):EF490131)的基礎(chǔ)上,本論文對(duì)推導(dǎo)的Ad-KPI-2及Ad-API-1的氨基酸序列進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析;構(gòu)建Ad-KPI-2及.Ad-API-1成熟肽原核表達(dá)系統(tǒng),在大腸桿菌(E.coli)中融合表達(dá)Ad-KPI-2

2、及Ad-API-1,并分離純化的重組Ad-KPI-2及Ad-API-1;檢測(cè)重組Ad-KPI-2的的活性并初步分析其作用機(jī)制。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究Ad-KPI-2及Ad-API-1的生物學(xué)功能并探討它們?cè)谥虏≈械淖饔玫於ɑA(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.Ad-KPI-2和Ad-API-1的生物信息學(xué)分析
　　 運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分別對(duì) Ad-KPI-2和 Ad-API-1的編碼序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及

3、理化性質(zhì)。
　　 2.Ad-KPbI-2、Ad-API-1的原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化
　　 分別從克隆質(zhì)粒中及cDNA中擴(kuò)增的Ad-KPI-2、Ad-API-1編碼成熟肽編碼序列,相應(yīng)編碼序列經(jīng)雙酶切后分別連接到表達(dá)載體pET-32a中,經(jīng)鑒定正確的表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a/Ad-KPI-2、pET-32a/Ad-API-1分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)后,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)情況用SDS-PAGE進(jìn)行

4、分析,大量誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白 Ad-KPI-2、Ad-API-1用Ni親和層析柱進(jìn)行純化備用。
　　 3.Ad-KPI-2的活性測(cè)定
　　 運(yùn)用發(fā)色底物法檢測(cè)重組融合蛋白Ad-KPI-2對(duì)α-胰糜蛋白酶、胰彈性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的抑制活性情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.生物信息學(xué)分析表明:Ad-KPI-2由84個(gè)氨基酸殘基組成,其成熟肽由68個(gè)氨基酸殘基組成,分子量為7923.9 Da,等電點(diǎn)

5、為6.15,含有典型的Kunitz型結(jié)構(gòu)域,是一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑。Ad-API-1由228個(gè)氨基酸殘基組成,其成熟肽由213個(gè)氨基酸殘基組成,分子量為23754.8 Da,等電點(diǎn)為5.79,含有P13結(jié)構(gòu)域,是一個(gè)典型的天冬氨酸蛋白酶抑制劑。
　　 2.成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a/Ad-KPI-2和pET-32a/Ad-API-1,用IPTG誘導(dǎo)獲得了重組Ad-KPI-2和Ad-API-1,并用鎳親和

6、層析獲得了純化的重組蛋白。
　　 3.初步實(shí)驗(yàn)表明重組融合蛋白Trx-Ad-KPI-2對(duì)α-胰糜蛋白酶和彈性蛋白酶具有顯著的抑制作用,但對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶無(wú)抑制作用。
　　 [結(jié)論]
　　 經(jīng)生物信息學(xué)分析表明Ad-KPI-2是一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑,Ad-API-1是一種天冬氨酸蛋白酶抑制劑。本文成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a/Ad-KPI-2和pET32a/Ad-API-1,并在大腸桿菌中