乙型肝炎病毒表面抗原與烯酰輔酶A水合酶相互作用及對細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：進一步驗證乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)與烯酰輔酶A水合酶(Enoyl CoA Hydratase，ECHS1)之間的相互作用，研究這種相互作用對宿主細(xì)胞的影響，探討HBsAg的長期持續(xù)表達在HBV致病機制中的作用。
　　方法：采用GST pull-down、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、激光共聚焦顯微鏡等多種方法進一步驗證 H

2、BsAg與 ECHS1之間的相互作用。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測瞬時及穩(wěn)定表達表面抗原主蛋白(Small hepatitis B surface antigen, SHBs)的肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中，ECHS1蛋白表達水平。流式細(xì)胞分析技術(shù)觀察穩(wěn)定表達SHBs的HepG2-SHBs細(xì)胞及對照細(xì)胞HepG2-neo對Camptothecin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性差異。為研究SHBs導(dǎo)致的ECHS1表達下降是否在

3、SHBs促凋亡中起作用，在HepG2-SHBs細(xì)胞中，利用siRNA技術(shù)下調(diào)ECHS1表達，或者轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ECHS1過表達ECHS1，流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測處理前后HepG2-SHBs對Camptothecin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性差異。
　　結(jié)果：1)SHBs與ECHS1體內(nèi)、體外存在直接的相互作用。GST pull-down實驗中GST-ECHS1蛋白能沉降SHBs，SHBs與ECHS1可在體外發(fā)生直接相互作用。免疫

4、共沉淀實驗中，用抗SHBs抗體能將ECHS1從細(xì)胞裂解液中沉淀下來，接著用抗ECHS1抗體行反向免疫共沉淀實驗，抗ECHS1抗體同樣能將SHBs沉淀下來。SHBs與ECHS1細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。我們采用熒光標(biāo)簽蛋白技術(shù)與激光共聚焦顯微鏡分析技術(shù)觀察了SHBs與ECHS1的亞細(xì)胞定位。SHBs與ECHS1可以在細(xì)胞漿中發(fā)生共定位。2)SHBs與ECHS1相互作用影響了ECHS1蛋白表達水平。在瞬時及穩(wěn)定表達SHBs的Huh7細(xì)胞和HepG

5、2細(xì)胞中，ECHS1蛋白表達水平均明顯下降。3)SHBs可以顯著增強了肝細(xì)胞對camptothecin誘導(dǎo)凋亡的敏感。誘導(dǎo)劑camptothecin處理后，HepG2-SHBs細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)較對照組HepG2-neo明顯增多。4)ECHS1在SHBs促凋亡的過程中的可能發(fā)揮著重要作用。ECHS1的siRNA轉(zhuǎn)染HepG2-SHBs細(xì)胞后，不僅進一步降低了細(xì)胞中的ECHS1的蛋白水平，更重要的是ECHS1的表達下降導(dǎo)致camptothe