奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定及其快速診斷方法的研究.pdf

1、近幾年來，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展甚為迅速，這對(duì)我國畜牧業(yè)的發(fā)展與繁榮有很大的促進(jìn)作用。但是，目前所暴露的不利于畜牧業(yè)發(fā)展的各種因素已越來越明顯，尤其是奶牛疾病方面的因素。眾所周知，奶牛的經(jīng)濟(jì)性能決定了繁殖是奶牛的頭等大事，奶牛不產(chǎn)犢就不能保證奶的產(chǎn)量，從而不可能保證良好的經(jīng)濟(jì)效益，更不能促進(jìn)乳制品工業(yè)的發(fā)展。 奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛不孕癥的重要原因之一，而奶牛不孕癥是一種主要的世界性經(jīng)濟(jì)問題(SaedOMetal，1983)。美國因

2、不孕癥造成的損失每年可達(dá)4～5億美元，英國報(bào)導(dǎo)不孕牛中約95％由子宮內(nèi)膜炎引起(瞿自明等，1986)。前蘇聯(lián)報(bào)導(dǎo)奶牛子宮炎的發(fā)病率占34.9～39.8％(張彥明，1998)，Andriamanga等對(duì)幾個(gè)牛群進(jìn)行了四年的研究，表明子宮炎的發(fā)病率占20～40％(Andriamanga，1984)。在國內(nèi)，奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率也很高，瞿自明等1983～1985年對(duì)北京、上海、南寧、蘭州等16個(gè)城市41個(gè)奶牛場調(diào)查的結(jié)果為，子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病

3、率為17.26％(張彥明，1998)，東北地區(qū)奶牛場的奶牛子宮內(nèi)膜炎占奶牛病的20～40％(瞿自明等，1986)。由此可見，奶牛子宮內(nèi)膜炎所造成的損失的繁殖和經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)嚴(yán)重，已在很大程度上制約了奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。 奶牛子宮內(nèi)膜炎的相關(guān)研究內(nèi)容，目前主要集中在病原菌的分離、鑒定及抗生素的治療效果上。資料表明，引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌絕大多數(shù)為條件性致病菌，專一性的致病菌只占很少一部分，這使開發(fā)“微生態(tài)制劑”治療奶牛子宮內(nèi)膜炎成

4、為可能。為此，本試驗(yàn)首先對(duì)健康奶牛產(chǎn)道內(nèi)正常菌群作了初步調(diào)查；為搞清產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)細(xì)菌動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，我們從不同奶牛場選出了20頭健康奶牛進(jìn)行了跟蹤采樣、調(diào)查；為臨床用藥提供依據(jù)，本試驗(yàn)對(duì)子宮內(nèi)膜炎患牛進(jìn)行了病原菌的分離、鑒定并進(jìn)行了耐藥性分析；為準(zhǔn)確的檢測子宮內(nèi)膜炎的病原菌，本試驗(yàn)針對(duì)主要病原菌建立了多重PCR快速檢測的方法；最后，針對(duì)沙門氏菌性子宮內(nèi)膜炎建立了多種血清型的多重PCR快速檢測的方法。具體內(nèi)容介紹如下： 首先，

5、我們對(duì)健康奶牛產(chǎn)道內(nèi)正常菌群作了初步的調(diào)查。結(jié)果表明，乳酸桿菌為正常奶牛產(chǎn)道內(nèi)的主要寄生菌，其次是表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌。但是未配青年牛的陰道內(nèi)，乳酸桿菌的分離率并不高。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，奶牛陰道內(nèi)的寄生菌一般為2～3種。其次，我們對(duì)產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)細(xì)菌動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，20頭產(chǎn)后奶牛的子宮均發(fā)生了細(xì)菌污染，子宮內(nèi)細(xì)菌的種類及其數(shù)量隨產(chǎn)后時(shí)間的不同，而呈現(xiàn)規(guī)律性的變化：在產(chǎn)后第2d，子宮內(nèi)呈污染狀態(tài)，細(xì)菌數(shù)量迅速

6、增加，四組(以奶牛場為單位分組，5頭/組)試驗(yàn)的計(jì)數(shù)結(jié)果分別達(dá)到了(8.34±0.66)×105、(2.15±0.55)×105、(1.90±0.51)×105、(2.97±0.29)×105，此后細(xì)菌數(shù)量呈緩慢增長趨勢，在產(chǎn)后第8d時(shí)子宮內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)達(dá)到最高，四組試驗(yàn)技術(shù)結(jié)果的平均數(shù)分別為：(4.25±1.72)×107、(4.01±1.61)×107、(3.95±1.42)×107、(3.05±1.12)×107。此外，還對(duì)對(duì)產(chǎn)后不同

7、階段所分離到的細(xì)菌的種類和數(shù)量進(jìn)行了詳細(xì)的比較與分析。 再次，為調(diào)查奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌，我們對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌進(jìn)行了分離、鑒定，并對(duì)病原菌進(jìn)行了耐藥分析。對(duì)山東省四個(gè)大型奶牛場的60頭子宮內(nèi)膜炎患牛進(jìn)行采樣，病原菌分離率如下：埃希氏大腸桿菌10株(16.95％)、葡萄球菌屬8株(13.6％)、芽孢桿菌屬6株(10.2％)、鏈球菌屬5株(8.5％)(其中溶血性鏈球菌2株)、棒狀桿菌屬5株(8.5％)、不動(dòng)桿菌屬5株(

8、8.5％)、雙球菌5株(8.5％)、腸桿菌屬4株(6.8％)、沙門氏菌3株(5.1％)、克雷伯氏桿菌屬2株(3.4％)、耶爾森菌屬2株(3.4％)、摩拉桿菌屬1株(1.7％)、而且分離到了梭菌屬3株(嚴(yán)格厭氧菌)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)病原菌對(duì)喹諾酮類藥物、阿莫西林、土霉素、及氨芐青霉素等藥物耐藥率較高，而對(duì)頭孢菌素類藥物和氨基糖苷類藥物耐藥率則相對(duì)較低。 由于傳統(tǒng)的鑒定細(xì)菌的方法十分繁瑣，并且耗時(shí)費(fèi)力。因此，我們對(duì)分離率較高

9、的金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌分別設(shè)計(jì)引物，然后用標(biāo)準(zhǔn)菌株建立了三重PCR的方法，并用該方法進(jìn)行了臨床檢測試驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法的敏感性是99％，特異性是100％，有效性是98％。其檢測的結(jié)果與常規(guī)生化鑒定結(jié)果相一致，未發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果，并且大大縮短了時(shí)間，有利于進(jìn)一步推廣使用。 在試驗(yàn)過程中，借助傳統(tǒng)的方法，我們從流產(chǎn)奶牛的病料中分離到了沙門氏菌。本試驗(yàn)針對(duì)常見的腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、牛病沙2門氏菌(C2血清型)、4

10、，5，12：Ⅰ血清型沙門氏菌的特異序列分別設(shè)計(jì)了引物。此外，還根據(jù)沙門氏菌屬外膜蛋白設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物。并用標(biāo)準(zhǔn)菌株建立多重PCR的快速檢測方法。結(jié)果表明，四株標(biāo)準(zhǔn)菌株均獲得了特異性的擴(kuò)增，這說明該方法完全可行。用該方法檢測樣品時(shí)，共檢測出了四份鼠傷寒沙門氏菌陽性樣品，檢測的結(jié)果與常規(guī)生化鑒定的結(jié)果相一致，未見假陽性現(xiàn)象。本試驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，沙門氏菌的確能夠引起奶牛的子宮內(nèi)膜炎并有可能導(dǎo)致懷孕奶牛的流產(chǎn)。并且首次建立了奶牛沙門氏菌性子宮內(nèi)