內(nèi)源性血管抑制因子抑制眼底新生血管的機(jī)理研究.pdf

1、新生血管性疾病(Neovascularization，NV)是當(dāng)今很多眼科疾病導(dǎo)致視力災(zāi)難性喪失甚至致盲的主要原因。在正常視網(wǎng)膜血管的發(fā)育過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cell，VEC)在各種細(xì)胞因子作用下增殖并通過細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)進(jìn)行遷移有序的形成血管。而在病理性NV形成過程中，在眼的相關(guān)部位如虹膜、視網(wǎng)膜、及脈絡(luò)膜可形成無序的，異常形態(tài)結(jié)構(gòu)及無功能的血管

2、形成。這些新生的血管很容易發(fā)生滲漏、出血、進(jìn)而引起視網(wǎng)膜水腫、纖維增生、視網(wǎng)膜玻璃體出血或牽引性視網(wǎng)膜脫離可以導(dǎo)致潛在的災(zāi)難性的視力喪失。
　　 本研究中，我們嘗試探討運(yùn)用內(nèi)源性血管抑制因子來治療和抑制眼底NV并簡要的討論眼底NV的發(fā)生機(jī)制。我們著重研究了內(nèi)源性血管生長抑制因子對于眼底NV的作用機(jī)制。內(nèi)源性血管抑制因子，是一組機(jī)體自身存在的抑制血管生成的負(fù)反饋分子，對機(jī)體正常生理作用的干預(yù)和影響小。在研究中我們發(fā)明了一種新的免疫

3、染色方法可以高質(zhì)量定性和定量的評價(jià)視網(wǎng)膜新生血管(Retinal neovascularization,RNV)以及脈絡(luò)膜新生血管(Choroidal neovascularization，CNV)。本研究提供了幾種眼底NV可行的新型治療靶點(diǎn)，不僅可以作為有價(jià)值的研究工具，并且可能具備潛在的治療前景。
　　 1、One Click Staining一種特殊的新生血管特異性免疫組織化學(xué)染色以用于研究新生血管和巨噬細(xì)胞關(guān)系研究

4、>　　 目的:本研究的日的是研究和探索新的染色方法以提高及規(guī)范化視網(wǎng)膜血管和新生血管(NV)的染色，對新生血管更準(zhǔn)確的進(jìn)行定性定量分析。
　　 方法:對缺氧誘導(dǎo)新生血管的小鼠，在出生后17天，對其視網(wǎng)膜表面產(chǎn)生的新生血管進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，分別運(yùn)用了熒光標(biāo)記的GSA lectin抗體和沒有熒光標(biāo)記的抗體和不同長度的染色時(shí)間。與此同時(shí)，在缺氧誘導(dǎo)新生血管模型小鼠出生后的第13，15，17，19，21,23，25天進(jìn)行全視網(wǎng)膜新

5、生血管和巨噬細(xì)胞的體外染色，鋪片拍照以觀察新生血管和巨噬細(xì)胞的關(guān)系。同時(shí)對出生后21天rho/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠采用同樣體外染色方法，可以特異性地染色視網(wǎng)膜下血管。
　　 結(jié)果:對缺氧誘導(dǎo)的小鼠新生血管模型（ROP模型）視網(wǎng)膜新生血管在用GSA標(biāo)記的Lectin抗體染色40分鐘后，可以觀察到清晰的新生血管的細(xì)微結(jié)構(gòu)包括新生血管前端的絲狀足突，并且視網(wǎng)膜原有的結(jié)構(gòu)血管沒有或者僅有少量背景顏色，非常利于使用圖像分析軟件來定性和定量的

6、評價(jià)新生血管。當(dāng)以GSA標(biāo)記的Lectin抗體和抗F4/80的抗體或者抗iNOS的抗體進(jìn)行視網(wǎng)膜雙重染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)iNOS在生長和退行過程中新生血管高表達(dá)，而在視網(wǎng)膜的其他部位則未見明顯表達(dá)。而且可以顯示巨噬細(xì)胞與新生血管的相關(guān)位置，進(jìn)而揭示巨噬細(xì)胞和新生血管以及新生血管退化之間的關(guān)系。對缺氧誘導(dǎo)的小鼠新生血管模型，在不同的時(shí)點(diǎn)P13，P15，P17，P19，P21，P23以及P25天，運(yùn)用這種染色方法觀察到視網(wǎng)膜表面新生血管以及巨噬細(xì)

7、胞分布，數(shù)量的明顯變化。運(yùn)用這種方法染色轉(zhuǎn)基因RhoNEGF小鼠同樣可以特異的染色出其視網(wǎng)膜下生長的新生血管。
　　 結(jié)論:本研究描述的體外染色技術(shù)可以準(zhǔn)確特異性地染色出新生血管。通過運(yùn)用這種方法，視網(wǎng)膜新生血管的特異結(jié)構(gòu)，得到了很好的染色顯示。聯(lián)合其他的抗體雙染視網(wǎng)膜新生血管，進(jìn)一步揭示了新生血管和各種其他炎性因子iNOS，以及巨噬細(xì)胞的相互關(guān)系。并且提供了簡單的方法對巨噬細(xì)胞進(jìn)行定義和精確計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞和iNOS

8、可能與眼內(nèi)血管的形成和消退緊密相關(guān)。
　　 2、內(nèi)源性血管抑制因子rhEDI-8t抑制RNV和CNV
　　 目的:本研究中，我們研究了重組血管內(nèi)皮抑制因子rhEDI-8t，一種從來自膠原Ⅷ的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，研究其對于在病理狀態(tài)下產(chǎn)生的RNV、CNV的抑制作用。
　　 方法:為了研究重組內(nèi)源性血管生長抑制因子rhEDI-8t對于新生血管的抑制作用，實(shí)驗(yàn)分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩大部分，在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中我們通過培養(yǎng)人類

9、臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況的增殖試驗(yàn)，和牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)遷移能力的遷移實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證rhEDI-8t在眼新生血管上是否有抑制作用作用。我們進(jìn)一步分別運(yùn)用了三種不同機(jī)制的眼新生血管動(dòng)物模型，包括了激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管(Choroidal neovascularization CNV)的小鼠動(dòng)物模型，5-6周大的C57BL/6雌性小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)雙盲分為四組。對照組和只療組分別予右眼眼內(nèi)注入

10、1μlPBS，或者1,2，5μg of rhEDI-8t(n=49，51，33，35;每個(gè)激光斑n=1)。第二天，使用激光光凝的方法在三個(gè)象限破壞小鼠的Bruch，s膜，并在兩周后測量CNV面積。缺氧誘導(dǎo)的小鼠新生血管模型( ROP)，將出生7天的B6小鼠放入75％氧箱后5天，P12天的小鼠返回正常氧濃度并給予一眼內(nèi)注射1μl1μg/μl rhEDI-8t，另一眼注入磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline，P

11、BS)作為對照。P17天，檢測RNV平均面積。以及視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞表達(dá)VEGF的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型(rho/VEGF mice)。rho/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后第14天，同窩小鼠的右眼隨機(jī)接受1μl(1μg/μl，n=10)endostatin或者1μl(1μg/μl，n=13) rhEDI-8t的眼內(nèi)注射，而左眼則接受1μlPBS作為對照。7天后，即出生后第21天，rho/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠麻醉后以FITC-Dextran做心腔灌注

12、后作全視網(wǎng)膜鋪片并用熒光顯微鏡鏡檢以及計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果:內(nèi)源性血管生長抑制因子rhEDI-8t在體外實(shí)驗(yàn)中，有效抑制了在bFGF刺激下人類臍血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙。在幾個(gè)體內(nèi)新生血管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，眼?nèi)注射rhEDI-8t的實(shí)驗(yàn)組，不論對脈絡(luò)膜新生血管的生成，視網(wǎng)膜新生血管，還是視網(wǎng)膜下新生血管都有明顯的抑制作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:內(nèi)源性血管生長抑制因子rhEDI-8t在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中