利用胎盤組織芯片檢測子癇前期患者胎盤組織中Wnt2b、WIF-1和E-cadherin的表達.pdf

1、子癇前期(Preeclampsia,PE)屬于妊娠高血壓疾病(Hypertensive disease of pregnancy,HDOP)，是妊娠期特有疾病。它是以妊娠20周以后高血壓(BP≥140/90mmHg)、水腫、蛋白尿（尿蛋白≥0.3g/24h或隨機尿蛋白+）為主要臨床表現(xiàn)的胎盤綜合征，是導致圍生兒和孕產(chǎn)婦發(fā)病和死亡的主要原因，目前國外發(fā)病率為5％-8％，國內(nèi)為9.4％。目前雖發(fā)現(xiàn)子癇前期的發(fā)病與胎盤因素、免疫因素、血管因素

2、、遺傳因素等均密切相關，但迄今為止子癇前期的發(fā)病機制尚未完全闡明。胎盤是妊娠期母胎的直接接觸面。由于子癇前期臨床癥狀在分娩后迅速消失（包括胎盤移除后），因此針對胎盤因素的研究成為子癇前期發(fā)病機制研究的熱點。滋養(yǎng)細胞是胎盤的主要細胞類型，其向母體子宮內(nèi)膜和肌層的侵襲、增殖和遷移對胎盤形成和胚胎著床至關重要。已有研究表明滋養(yǎng)細胞侵襲不足和子宮螺旋動脈重鑄不完全導致的胎盤淺著床、胎盤缺血與子癇前期的發(fā)病相關。
　　Wnt信號通路是自然界

3、普遍存在且非常保守的信號通路，是調控細胞生長發(fā)育、增殖、遷徙和分化的關鍵信號通路之一，在多種腫瘤中均存在Wnt信號通路的異常。Wnt2b/Wnt13是經(jīng)典Wnt通路的始動因子之一，通過激活經(jīng)典Wnt信號通路來抑制細胞凋亡、促進細胞侵襲和血管生成等作用而參與腫瘤的進展。Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor-1，WIF-1)屬于分泌型卷曲相關蛋白家族，通過與Wnt配體競爭結合Frizzled受體從而阻斷Wnt信號通路

4、。E-鈣粘連蛋白(E-cadherin，E-cad)是胞膜上重要的細胞粘附分子和信號轉導分子，是反映細胞侵襲性的主要指標，通過與細胞內(nèi)的β連環(huán)蛋白(β-catenin)結合形成復合體以降低其胞內(nèi)濃度，從而抑制Wnt信號通路。最近研究表明Wnt信號通路參與人類滋養(yǎng)細胞的分化及侵襲過程，但利用大樣本量的胎盤組織樣本研究以上三種因子與子癇前期的關系還未見報道。而子癇前期胎盤組織芯片的構建為子癇前期蛋白質的表達研究提供了高效、重復性好、外界影響

5、因素最小的檢測工具。本課題利用兩種類型的的胎盤組織芯片，即絨毛滋養(yǎng)細胞(villous cytotrophoblast，VCT)和絨毛外滋養(yǎng)細胞(extrovillous cytotrophoblast,EVCT)組織芯片檢測正常晚孕組和子癇前期組Wnt2b、WIF-1和E-cad蛋白的表達，分析其在正常晚孕組和子癇前期及其不同分型中的表達變化，然后利用Real-time PCR檢測兩組胎盤組織中Wnt2b、WIF-1和E-cad mR

6、NA的表達，初步探討Wnt信號通路中Wnt2b、WIF-1和E-cad的表達與子癇前期發(fā)病的相關性。
　　目的：
　　本課題利用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）、VCT和EVCT組織芯片技術檢測正常晚孕組和子癇前期組產(chǎn)婦胎盤組織中Wnt2b、WIF-1和E-cad的蛋白表達情況，然后利用Real-time PCR檢測正常晚孕組和重度子癇前期組產(chǎn)婦胎盤組織中Wnt2b、WIF-1和E-cad的mRN

7、A表達情況，初步探討Wnt信號通路中上述三種因子在子癇前期發(fā)病機制中的作用。
　　材料和方法：
　　1、研究對象
　　1.1、Real-time PCR研究對象
　　收集2011年12月到2012年12月間在鄭州大學第三附屬醫(yī)院住院，臨床診斷為重度子癇前期的患者胎盤30例作為病例組，正常足月妊娠妊娠產(chǎn)婦胎盤30例作為正常對照組用于mRNA的檢測;
　　1.2、組織芯片研究對象
　　河南省婦幼健康轉化醫(yī)

8、學工程實驗室收集2007年12月到2010年12月間在鄭州大學第三附屬醫(yī)院住院，臨床診斷為子癇前期的患者胎盤80例，同期正常晚孕產(chǎn)婦胎盤58例用于子癇前期胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞(VCT)和絨毛外滋養(yǎng)細胞(EVCT)組織芯片的構建。利用胎盤組織芯片進行蛋白表達的檢測。
　　1.3、研究對象入選標準
　　重度子癇前期的診斷標準嚴格按照2002年美國婦產(chǎn)科學協(xié)會和人民衛(wèi)生出版社出版的第七版《婦產(chǎn)科學》的診斷標準。所有入選對象均為剖宮產(chǎn)、

9、單活胎，排除合并原發(fā)性高血壓、腎病、糖尿病、抗磷脂綜合征、多囊卵巢綜合征、胎兒畸形以及其他妊娠合并癥病史。
　　2、胎盤組織芯片情況
　　2.1、組織芯片的驗證
　　通過波形蛋白、細胞角蛋白和HLA-G抗體免疫組化染色驗證VCT和EVCT組織芯片，結果顯示:組織芯片中VCT細胞角蛋白陽性，波形蛋白染色陰性，符合VCT組織的特點;EVCT細胞角蛋白染色陽性，波形蛋白染色陰性，HLA-G染色陽性，符合EVCT組織的特點。這

10、表明胎盤組織芯片是成功構建的。
　　2.2、組織芯片H&E染色結果
　　H&E染色表明:VCT組織芯片中98.98％(97/98)的樣本保留有目的組織且染色效果好，即在VCT組織芯片上能分析56例子癇前期（其中按病情程度劃分包括:重度PE48例，輕度PE8例;按發(fā)病時間劃分包括:早發(fā)型PE41例，晚發(fā)型PE15例）和42例正常對照組胎盤組織樣本;EVCT組織芯片中86.36％(76/88)的樣本保留有目的組織且染色效果好，即

11、在EVCT組織芯片上能分析47例子癇前期（其中按病情程度劃分包括:重度PE44例，輕度PE3例;按發(fā)病時間劃分包括:早發(fā)型PE38例，晚發(fā)型PE9例）和29例正常對照組胎盤組織樣本。由于VCT和EVCT組織芯片中輕度PE和晚發(fā)型PE樣本例數(shù)不足，因此重點分析組織芯片中重度PE和早發(fā)型PE中蛋白質的表達。
　　3、實驗方法
　　3.1、利用免疫組化、組織芯片技術檢測Wnt2b、WIF-1和E-cad在胎盤組織中的定位和表達

12、r>　　將胎盤VCT和EVCT組織芯片切至4μm厚切片，免疫組化檢測Wnt2b、WIF-1和E-cad蛋白在兩種組織芯片中正常晚孕組和子癇前期組胎盤組織中的定位和表達。
　　3.2、Real-time PCR檢測正常晚孕組和重度子癇前期組胎盤組織中Wnt2b、WIF-1和E-cad mRNA的表達
　　Trizol法提取胎盤中的總RNA后反轉錄為cDNA，采用染料法進行實時熒光定量PCR。以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為

13、內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCT法分析Wnt2b、WIF-1和E-cad mRNA在正常晚孕和子癇前期組胎盤中的相對表達量。
　　4、統(tǒng)計學處理
　　所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料采用非參數(shù)秩和檢驗。計數(shù)資料用率表示，組織芯片的免疫組化結果通過統(tǒng)計每個染色強度等級的例數(shù)后，采用有序多分類資料的秩和檢驗進行

14、兩組間的比較。以α=0.05為檢驗水準。
　　結果：
　　1、重度子病前期組和正常對照組產(chǎn)婦一般臨床資料的比較
　　重度子癇前期組及正常對照組產(chǎn)婦年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。重度子癇前期組產(chǎn)婦收縮壓、舒張壓和蛋白尿情況顯著高于正常對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。重度子癇前期組產(chǎn)婦生產(chǎn)時孕周、新生兒體重均小于正常對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2、重度子癇前期組

15、與正常對照組產(chǎn)婦胎盤組織中Wnt2b、WIF-1及E-cadmRNA的表達
　　兩組產(chǎn)婦胎盤組織中均可檢測到Wnt2b、WIF-1和E-cad mRNA的表達。重度子癇組中Wnt2b mRNA的相對表達量為0.34±0.21，正常對照組為1.17±0.66，重度子癇前期組中Wnt2b mRNA的表達低于正常對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。重度子癇前期組中WIF-1 mRNA的相對表達量為1.52±1.09，正常對

16、照組為1.18±0.65，兩組比較無統(tǒng)計學差異(P=0.66)。重度子癇組中E-cad mRNA的相對表達量為1.13±0.57，正常對照組為0.43±0.25，重度子癇前期組中E-cad mRNA的表達水平高于正常對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3、VCT和EVCT組織芯片中子癇前期組與正常對照組Wnt2b、WIF-1及E-cad蛋白的表達和定位
　　Wnt2b、WIF-1和E-cad蛋白主要表達于

17、胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞和侵入底蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細胞，Wnt2b主要表達于細胞膜和細胞質中，WIF-1主要表達于細胞膜和細胞外基質中，E-Cad主要表達于細胞膜上。IHC顯示，VCT和EVCT組織芯片中，子癇前期組中Wnt2b的染色強度明顯低于正常對照組，WIF-1和E-cad的染色強度明顯高于正常對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。此外，VCT和EVCT組織芯片中重度PE組、早發(fā)型PE組中Wnt2b的染色強度明顯低于正常對