四個(gè)HBV感染相關(guān)候選基因的SNP關(guān)聯(lián)研究及初步功能鑒定.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)主要的感染病之一，從無(wú)癥狀攜帶者、急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化到肝細(xì)胞癌，形成了復(fù)雜的疾病譜。持續(xù)感染的形成以及疾病進(jìn)程與諸多因素有關(guān)，如年齡、性別、宿主的免疫狀態(tài)、HBV基因型、是否合并其他肝炎病毒感染等。已有研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素可導(dǎo)致臨床表現(xiàn)會(huì)有很大差異，宿主因素尤其是宿主基因可能影響HBV感染和疾病進(jìn)程的許多階段。常見(jiàn)復(fù)雜疾病由許多微效累加基因與環(huán)境因素共同

2、作用而決定，這些不同基因構(gòu)成的遺傳背景中，其中每種基因的作用相對(duì)微弱，同時(shí)還受環(huán)境因素的制約，彼此間相互作用錯(cuò)綜復(fù)雜。所以任一基因的多態(tài)性對(duì)疾病發(fā)生僅起微弱的作用。目前引起生命科學(xué)界廣泛關(guān)注的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)近年來(lái)成為多種疾病研究的焦點(diǎn)，成為第三代遺傳標(biāo)記。HBV感染遺傳易感性受到多種層次和水平的制約，涉及到宿主HLA、細(xì)胞因子及其受體、淋巴細(xì)胞共刺激分子及其配體、其他免

3、疫應(yīng)答基因、肝特異性轉(zhuǎn)錄因子、病原體受體等基因多態(tài)性。很顯然，HBV感染的遺傳易感性是受許多微效累加基因和某些環(huán)境因素共同作用引起的。以生物學(xué)功能相關(guān)基因作為候選基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究是當(dāng)前感染病遺傳易感性研究的主要策略，而在HBV感染的遺傳易感性研究中疾病關(guān)聯(lián)研究最常用。目前各國(guó)科學(xué)家對(duì)乙型肝炎候選致病基因的SNP的研究作出了巨大努力，我國(guó)為乙型病毒性肝炎高發(fā)地區(qū)，國(guó)內(nèi)此方面研究正初見(jiàn)端倪。我們基于已有的功能研究提示選擇與HBV感染生物學(xué)功

4、能相關(guān)的凝血酶原酶或纖維介素(prothrombinase/fibroleukin，F(xiàn)GL2)，內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)，高移動(dòng)率族蛋白(highmobilitygroupbox1，HMGB1)，3羥基3甲基戊二酸輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase，HMGCR)四個(gè)基因作為候選基因： 1.FG

5、L2由活化的巨噬細(xì)胞表達(dá)，具有凝血酶原酶的活力，能催化凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶啟動(dòng)凝血過(guò)程。而目前凝血酶的激活可能在重型肝炎發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。研究認(rèn)為FGL2在肝組織活化枯普弗細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中的異常表達(dá)，是重型乙型肝炎肝細(xì)胞壞死重要的分子機(jī)制之一。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)與HBV感染相關(guān)的FGL2基因多態(tài)性的研究報(bào)道。 2.一氧化氮(nitricoxide，NO)及一氧化氮合酶是近年來(lái)生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最熱點(diǎn)課題之一，與病毒性肝炎的

6、病情密切相關(guān)。NO是體內(nèi)產(chǎn)生的最強(qiáng)的舒張血管因子。NOS是合成NO的唯一限速酶。NO作為一種強(qiáng)有力的內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子，其功能已越來(lái)越受到人們的重視。肝臟作為人體代謝的重要器官也合成NO，且存在催化NO合成的NOS酶，即肝內(nèi)血管和血竇內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS與肝細(xì)胞和枯普弗細(xì)胞中的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。eNOS基因催化生成的NO可舒張血管、調(diào)節(jié)肝臟血流，對(duì)肝臟具保護(hù)作用，研究證實(shí)的許多對(duì)肝臟有保護(hù)作用的如雌激素受體，HMGCR抑制

7、劑等一定程度上都與誘導(dǎo)了eNOS的表達(dá)有關(guān)。其基因的多態(tài)性與高血壓、腦缺血、青光眼、糖尿病、妊高征等疾病的相關(guān)性已有報(bào)道，而作為HBV感染率相當(dāng)高的中國(guó)，目前尚未見(jiàn)與HBV感染相關(guān)的eNOS基因多態(tài)性的研究出現(xiàn)。 3.HMGB1傳統(tǒng)認(rèn)為是一種非組蛋白的染色體DNA結(jié)合蛋白，參與維持核小體結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等，除了細(xì)胞內(nèi)的這些作用，最近發(fā)現(xiàn)HMGB1是炎癥反應(yīng)的晚期介質(zhì)，可由活化的巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌，為內(nèi)源性的促炎細(xì)胞因子、腫

8、瘤壞死因子和IL1的誘導(dǎo)蛋白及內(nèi)毒素血癥的遲發(fā)中介體，通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞因子的釋放擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。眾所周知，HBV感染與炎癥因子的關(guān)系密切，HMGB1在肝臟可有相當(dāng)高的表達(dá)，但有關(guān)HMGB1與HBV感染的研究至今鮮見(jiàn)報(bào)道。 4.HMGCR是體內(nèi)催化由乙酰輔酶A(CoA)合成甲羥戊酸(Mevalonicacid，MA)這一代謝途徑的關(guān)鍵酶，是肝臟膽固醇合成的限速酶。其抑制劑除降低膽固醇的作用，還可通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS的表達(dá)及活

9、化發(fā)揮其心血管保護(hù)作用、顯著減輕缺血再灌注鼠的肝損傷、對(duì)鼠有肝切除和肝移植后的肝臟保護(hù)作用，雖然HMGCR抑制劑與不同肝病的關(guān)系報(bào)道很多，但有關(guān)HMGCR基因本身與不同肝病的關(guān)系報(bào)道很少。 我們參考Genbank基因信息選擇選擇等位頻率較高的HMGB1基因第4內(nèi)含子位點(diǎn)1176G/C、eNOS基因第7外顯子位點(diǎn)894G/T、HMGCR基因第20外顯子位點(diǎn)18109T/C、FGL2基因位點(diǎn)啟動(dòng)子位點(diǎn)-1285T/A以及第1外顯子位

10、點(diǎn)111T/C等SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩查，在HBV感染人群中進(jìn)行分型探討其基因多態(tài)性與HBV感染之間有否關(guān)聯(lián)存在，從遺傳流行病角度探討4個(gè)候選基因多態(tài)性與HBV感染以及疾病進(jìn)程的關(guān)系。我們主要研究結(jié)果如下： 1.我們共收集到2561份標(biāo)本，其中男性1930人，女性631人，涵蓋了正常對(duì)照人群、乙肝病毒攜帶者、慢性乙型肝炎、重型乙型肝炎、肝硬化等臨床分組，成功提取DNA后制備成96孔模板。 2.首先在收集樣本中隨機(jī)挑選188份小

11、樣本人群進(jìn)行候選基因SNP位點(diǎn)初篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除FGL2基因位點(diǎn)111T/C在我們所收集的初篩人群中等位基因頻率為0，與公共數(shù)據(jù)庫(kù)顯示此位點(diǎn)的等位基因頻率20.8％存在差異，放棄擴(kuò)大樣本繼續(xù)檢測(cè)；其余位點(diǎn)等位基因頻率均大于5％，繼續(xù)在大樣本人群中檢測(cè)進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究。 3.HMGB11176G/C、eNOS894G/T、HMGCR18109T/C、FGL2(-1285T/A)繼續(xù)擴(kuò)大樣本研究發(fā)現(xiàn)：在病例與對(duì)照人群中上述基因型與等位基因

12、頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明這些位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與HBV的清除無(wú)關(guān)。進(jìn)一步以非條件logistic回歸校正年齡及性別因素進(jìn)行位點(diǎn)多態(tài)性與HBV感染臨床表型的關(guān)聯(lián)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： HMGB1基因1176G/C位點(diǎn)與HBV感染存在關(guān)聯(lián)。在共顯性模式下，HMGB1位點(diǎn)1176G/CSNP與疾病嚴(yán)重程度顯著關(guān)聯(lián)。與HMGB11176C/C，1176G/C基因型相比，1176G/G基因型發(fā)展為HBV持續(xù)感染嚴(yán)重臨床表型(慢性乙型肝炎；肝硬化；

13、重型肝炎)的易感性顯著升高(共顯性模式：AsC/CHB+LC：P=0.007，OR=1.355，95％CI=1.088-1.687；AsC/CHB+SHB+LC：P=0.010，OR=1.329，95％CI=1.070-1.651)。 eNOS基因位點(diǎn)894G/T與HBV感染存在關(guān)聯(lián)。在隱性模式和共顯性模式下，eNOS基因位點(diǎn)894G/T與HBV感染后疾病的嚴(yán)重程度顯著關(guān)聯(lián)。與894G/T和T/T基因型相比，G/G基因型的個(gè)體發(fā)

14、展為持續(xù)HBV感染嚴(yán)重臨床表型的易感性顯著增高(隱性模式：AsC/LC+CHB+SHB：P=0.023，OR=1.428，95％CI=1.050-1.942：AsC/CHB+SHB：P=0.023，OR=1.428，95％CI=1.050-1.942；共顯性模式：AsC/LC+CHB+SHB：P=0.031，OR=1310，95％CI=1.025-1.676；AsC/CHB+SHB：P=0.027，OR=1.325，95％CI=1.03

15、3-1.700)。 HMGCR基因位點(diǎn)18109T/C與HBV感染存在關(guān)聯(lián)。 4.我們繼續(xù)對(duì)關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)HMGB1-intron4-1176G/C進(jìn)行了初步功能研究。 5.上述觀察發(fā)現(xiàn)eNOS第7外顯子894G/T多態(tài)性與HBV感染后的臨床表型顯著相關(guān)，由此促使我們懷疑是否單核苷酸多態(tài)性造成內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性的變化進(jìn)而影響肝病的進(jìn)程呢?我們?cè)噲D觀察血小板內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性與eNOS單核苷酸多態(tài)性之間的

16、關(guān)系，對(duì)此作一初探。我們?cè)谡?72名獻(xiàn)血員中進(jìn)行了eNOS基因第7外顯子894T/G多態(tài)性檢測(cè)，同時(shí)收集血小板利用同位素二步色譜法測(cè)定NOS活性，將外界的影響因素盡可能降至最低又具體定位于血小板。結(jié)果顯示各基因型之間NOS活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析原因可能eNOS基因第7外顯子894G/T多態(tài)性與NOS活性之間確實(shí)無(wú)內(nèi)在聯(lián)系，其與眾多疾病的關(guān)聯(lián)僅限于一種遺傳標(biāo)記而已；或可能由于本實(shí)驗(yàn)收集樣本例數(shù)太少導(dǎo)致誤差增大，以后應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本檢測(cè)驗(yàn)證

17、。 總之，我們?cè)谌后w水平和流行病學(xué)角度首次證實(shí)HMGB1基因位點(diǎn)1176G/C、eNOS基因位點(diǎn)894G/T、HMGCR基因位點(diǎn)18109T/C多態(tài)性與HBV感染的關(guān)聯(lián)存在；觀察到HMGB1基因內(nèi)含子4區(qū)(+1144～+1296bp)154bp片段序列為潛在增強(qiáng)子元件，作用于其上游的啟動(dòng)子從而增強(qiáng)基因的表達(dá)；HMGB1基因內(nèi)含子區(qū)(1144～1296bp)單核苷酸1176G→C的改變，可使此片段所具有的增強(qiáng)子功能大大提高。未觀察