間充質干細胞釋放的微粒通過傳遞角質細胞生長因子mRNA保護內毒素所致的小鼠急性肺損傷.pdf

1、[目的]本研究組的先前研究證實，間充質干細胞能夠通過細胞旁分泌的方式釋放足量的角質細胞生長因子，這些生長因子在調節(jié)肺水清除率以及減輕肺水腫的過程中起了決定性作用。目前發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞能夠釋放一種100納米至1微米大小的膜微粒，這種類球型的無核顆粒包涵了眾多來自于干細胞的蛋白質、mRNA、microRNA、細胞器以及脂質等成分，已經(jīng)證實這些微粒在參與細胞間信號傳遞的過程中起了關鍵作用。鑒于這些線索，我們假定微?？赡懿糠滞ㄟ^傳遞角質細胞生

2、長因子的mRNA至受損的肺泡上皮及肺內皮細胞從而保護急性肺損傷，擬通過本研究證實這一可能的作用機制。
　　[方法](1)人骨髓間充質干細胞釋放微粒的分離提純:將間充質干細胞置于條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時后收集上清。經(jīng)過超高速離心后分離微粒，按照10μl微粒相當于1×106的間充質干細胞的比例提純微粒。(2)內毒素所致小鼠急性肺損傷模型的建立:小鼠經(jīng)氣管內給予內毒素(4mg/kg)建立急性肺損傷模型。按照不同的處理進行分組:內毒素+間充

3、質干細胞氣管給藥治療組(LPS+MSC):內毒素+間充質干細胞微粒靜脈給藥治療組(LPS+1×MSC MV IV);內毒素+單倍劑量間充質干細胞微粒氣管給藥治療組(LPS+1×MSC MV IT);內毒素+雙倍劑量間充質干細胞微粒氣管給藥治療組(LPS+2×MSC MV IT);內毒素+成纖維細胞微粒氣管給藥治療組（LPS+NHLF MV）。(3)標本的采集和檢測:48小時后對各組小鼠的外周血、肺泡灌洗液、肺組織進行細胞學、病理學研究。

4、利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清及肺泡灌洗液中的MIP-2濃度，并用二辛可寧酸法測定肺泡灌洗液中的蛋白含量。(4)用KGF siRNA干擾處理間充質干細胞來干擾細胞釋放的微粒中的KGF mRNA:行RT-PCR證實。(5)接著，用KGFsiRNA干擾微粒處理急性肺損傷小鼠模型:將小鼠隨機分為內毒素組(4mg/kg);內毒素+間充質干細胞KGF siRNA干擾預處理微粒氣管給藥治療組(LPS+KGFsiRNA MV);內毒素+間充

5、質干細胞Negative siRNA干擾預處理微粒氣管給藥治療組(LPS+Negative siRNA MV)。(6)標本的采集和檢測:48小時后對各組小鼠的外周血、肺泡灌洗液、肺組織進行細胞學研究以及肺血管外水含量的檢測。(7)小鼠肺巨噬細胞系RAW264.7細胞與間充質干細胞微粒的體外共培養(yǎng):在不同時間點（6小時、12小時、24小時）收集培養(yǎng)液上清，用ELISA測定MIP-2、TNF-α、及IL-10的濃度。(8)統(tǒng)計學方法:用SP

6、SS及Prism統(tǒng)計軟件，變量以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組計量資料間比較采用one-way ANOVA分析及Bonferroni校正檢驗分析，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　[結果](1)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質干細胞釋放的微粒能減少小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中白細胞的聚集:與單純內毒素組相比，內毒素+間充質干細胞微粒組肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)下降36％，P＜0.05;內毒素+間充質干

7、細胞微粒組肺泡灌洗液中中性粒細胞計數(shù)亦下降73％，P＜0.05。(2)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質干細胞釋放的微粒能抑制小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中炎癥細胞因子的釋放以及蛋白的滲出:與單純內毒素組相比，內毒素+間充質干細胞微粒組肺泡灌洗液中MIP-2含量下降49％，P＜0.05;內毒素+間充質干細胞微粒組肺泡灌洗液中總蛋白含量亦下降35％，P＜0.05。(3)經(jīng)靜脈給予人骨髓間充質干細胞釋放的微粒同樣能減少小鼠急性肺損傷模型肺泡灌洗液中的中

8、性粒細胞并抑制蛋白的滲出:與單純內毒素組相比，內毒素+間充質干細胞微粒靜脈給藥組的肺泡灌洗液中中性粒細胞計數(shù)下降49％，同時總蛋白含量亦下降34％，P＜0.05。(4)經(jīng)氣管給予人骨髓間充質干細胞釋放微粒的劑量效應:當氣管給予雙倍劑量間充質干細胞釋放的微粒時，肺泡灌洗液中性粒細胞及MIP-2含量較之單倍劑量的微粒僅有輕度下降，無統(tǒng)計學差異。(5) LPS體外刺激RAW264.7細胞與間充質干細胞及微粒共培養(yǎng)不同時間后上清液炎癥因子的變化

9、:與單純LPS刺激組相比，干細胞組及微粒組在共培養(yǎng)6小時后IL-10水平明顯上升，有統(tǒng)計學差異。12小時后，微粒組仍然較單純LPS組明顯升高。但24小時后，干細胞組及微粒組的IL-10水平回復至單純LPS組水平;微粒組在共培養(yǎng)6小時后TNF-α水平明顯下降，有統(tǒng)計學差異。12小時后，干細胞組及微粒組TNF-α水平均有減少，且趨勢持續(xù)至24小時;微粒組在共培養(yǎng)6小時后MIP-2水平明顯下降，有統(tǒng)計學差異。12小時后，干細胞組及微粒組MIP

10、-2水平均有減少，且趨勢持續(xù)至24小時，變化趨勢類似于TNF-α。(6) KGF siRNA干擾處理的間充質干細胞微粒對于急性肺損傷小鼠模型的作用:與內毒素+Negative siRNA干擾預處理微粒組相比，內毒素+KGFsiRNA干擾預處理微粒組肺泡灌洗液中中性粒細胞計數(shù)上升47％;內毒素+KGFsiRNA干擾預處理微粒組肺泡灌洗液中MIP-2含量上升56％。(7)急性肺損傷小鼠模型肺血管外水含量的變化:與單純內毒素組相比，給予間充質

11、干細胞釋放的微粒組的肺血管外水含量減少45％，其保護作用類似于間充質干細胞組;與內毒素+Negative siRNA干擾預處理微粒組相比，內毒素+KGF siRNA干擾預處理微粒組的肺血管外水含量增加24％。
　　[結論](1)在內毒素所致的小鼠急性肺損傷模型中，無論是靜脈還是氣管給藥，人骨髓間充質干細胞釋放的微粒能抑制炎癥細胞（如中性粒細胞）的聚集，減少炎癥因子（如MIP-2）的釋放以及肺泡內蛋白的滲出;(2)更重要的是，給予間

12、充質干細胞微粒能減少肺血管外水含量（反映肺水腫的指標）;(3)間充質干細胞釋放微粒的保護作用類似于間充質干細胞本身;(4)間充質干細胞釋放的微粒包涵KGF mRNA，之前的研究已經(jīng)證實KGF是間充質干細胞分泌的因子，參與維持肺泡內液體清除的功能;(5)無論是靜脈還是氣管給予間充質干細胞釋放的微粒，肺泡灌洗液中KGF蛋白的含量均明顯升高;(6)經(jīng)KGF siRNA干擾處理的間充質干細胞微粒，其保護作用部分消失，結果提示微粒可能部分通過傳遞