PR啟動(dòng)子區(qū)H3ac、H4ac及H3K4me3對(duì)分娩啟動(dòng)作用的研究.pdf

1、關(guān)于人類(lèi)分娩啟動(dòng)機(jī)制的學(xué)說(shuō)很多,但妊娠過(guò)程中子宮如何由靜息轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s狀態(tài)導(dǎo)致分娩開(kāi)始的具體機(jī)制仍未完全闡明。子宮平滑肌細(xì)胞所處的狀態(tài)受到多種激素的調(diào)節(jié),其中孕激素在維持其保持靜息及舒張狀態(tài)中起重要作用,它通過(guò)抑制子宮平滑肌細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、抑制催產(chǎn)素分泌、促進(jìn)β-腎上腺素能受體的表達(dá)等機(jī)制來(lái)確保平滑肌細(xì)胞處于松弛狀態(tài)。
　　大多數(shù)非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物分娩的啟動(dòng)伴有血漿孕激素的下降,而人類(lèi)妊娠有別于其他動(dòng)物:妊娠后期母體中血漿孕激素并未下

2、降,而是與血漿雌激素共同升高。這說(shuō)明人類(lèi)分娩的發(fā)動(dòng)并不需要孕激素(至少是血漿中雌激素)下降的參與。但是研究卻發(fā)現(xiàn)孕激素在人類(lèi)分娩中起重要作用,因?yàn)樵屑に厥荏w拮抗劑無(wú)論在妊娠的任何階段運(yùn)用后均可導(dǎo)致宮縮開(kāi)始,分娩啟動(dòng)。這一現(xiàn)象說(shuō)明:人類(lèi)分娩機(jī)制雖然血清中孕激素水平并未下降,但是“功能性的孕激素”水平卻是降低的——“功能性的孕激素撤退”可能是分娩啟動(dòng)機(jī)制的主要原因。
　　目前認(rèn)為引起“功能性的孕激素撤退”機(jī)制的原因主要有:①人類(lèi)孕激素

3、受體(progesterone receptor,PR)亞型的變化;②子宮平滑肌局部環(huán)境使孕激素代謝為無(wú)活性的成分;③輔活化因子水平的變化使PR的轉(zhuǎn)錄活性變化;④NFкB的反抑制作用。其中PR受體亞型的變化導(dǎo)致妊娠子宮平滑肌細(xì)胞對(duì)孕激素敏感性改變而啟動(dòng)產(chǎn)程機(jī)制擁有諸多實(shí)驗(yàn)證據(jù)予以支持。
　　PR基因長(zhǎng)度約為90kb,內(nèi)含8個(gè)內(nèi)顯子序列,位于11q22-23。PR有PRA、PRB兩種亞型,PRA基因N端比PRB基因N端少164個(gè)氨基

4、酸,因此它們的結(jié)構(gòu)和功能都存在很大差異, PRB具有轉(zhuǎn)錄活性,而PRA則發(fā)揮抑制PRB的作用;此外,PRB可以通過(guò)結(jié)合孕激素后起到維持子宮平滑肌舒張狀態(tài)的作用,而PRA則拮抗該作用。大量研究結(jié)果顯示:在人類(lèi)分娩啟動(dòng)前后,子宮平滑肌細(xì)胞PRA表達(dá)量相對(duì)PRB升高,導(dǎo)致二者比列發(fā)生改變,進(jìn)而平滑肌細(xì)胞對(duì)孕激素的敏感性發(fā)生改變,提示PRA與PRB的比例發(fā)生變化可能是分娩啟動(dòng)機(jī)制中的關(guān)鍵因素。而對(duì)不同組織中的研究均發(fā)現(xiàn)表觀遺傳對(duì) PRs的基因表

5、達(dá)均有顯著影響?？梢院侠硗茰y(cè),PR基因表觀遺傳學(xué)修飾可通過(guò)改變PRA、PRB表達(dá)及二者相對(duì)比例變化進(jìn)而在“功能性的孕激素撤退”機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
　　本項(xiàng)目以妊娠子宮平滑肌組織為研究對(duì)象,采用免疫組化、western blot、實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測(cè)分娩發(fā)動(dòng)前后PRA、PRB的表達(dá)變化;通過(guò)ChIP檢測(cè)分娩發(fā)動(dòng)前后子宮平滑肌PR啟動(dòng)子區(qū)H3ac、H4ac、H3K4me3水平。組蛋白乙?；敢种苿┣敲顾谹(trichostat

6、inA, TSA)、H3K4甲基化酶抑制劑5-脫氧-5-甲硫腺苷(5’-deoxy-5’-methylthioadenosine, MTA)處理子宮平滑肌細(xì)胞系前后檢測(cè)PRA及PRB啟動(dòng)子區(qū)乙?；⒓谆阶兓?初步探討:①產(chǎn)程啟動(dòng)前后,PRs啟動(dòng)子區(qū)乙?；潭仁欠癜l(fā)生變化;②子宮平滑肌細(xì)胞PRs啟動(dòng)子區(qū)乙?；揎検欠裼绊慞RA、PRB基因的表達(dá);③PRA、PRB啟動(dòng)子區(qū)乙?；揎検欠衽c“功能性孕激素撤退”分娩啟動(dòng)機(jī)制相關(guān)。為探討控制

7、分娩啟動(dòng)的有效環(huán)節(jié),防治早產(chǎn)及過(guò)期產(chǎn)提供新理論依據(jù)。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明,PR及其亞型在啟動(dòng)組及未啟動(dòng)組的子宮平滑肌細(xì)胞核中都有明顯的表達(dá)。啟動(dòng)組PRA的表達(dá)及PRA/PRB比值比未啟動(dòng)組顯著升高,但PRB未見(jiàn)明顯升高,說(shuō)明PRA的表達(dá)及PRA/PRB比值升高可能與分娩啟動(dòng)機(jī)制相關(guān)。
　　通過(guò)ChIP檢測(cè)PRA、PRB啟動(dòng)子區(qū)的H3、H4乙?；癏3K4三甲基化水平,結(jié)果顯示:相比較于產(chǎn)程未啟動(dòng)組產(chǎn)程啟動(dòng)組妊娠子宮平滑肌H3、

8、H4乙?；綗o(wú)論是在PRA還是PRB的啟動(dòng)子區(qū)的均未見(jiàn)明顯改變,而H3K4三甲基化水平在兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)均顯著升高。據(jù)此我們認(rèn)為,產(chǎn)程啟動(dòng)組子宮平滑肌PRA表達(dá)增高主要是由其H3K4三甲基化作用而引起的。隨后,我們分離、純化培養(yǎng)未啟動(dòng)子宮平滑肌細(xì)胞,并加用TSA、MTA進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)TSA可顯著提高PRA mRNA的表達(dá),MTA可顯著抑制其表達(dá),而ChIP檢測(cè)提示TSA、MTA干預(yù)后PRA啟動(dòng)子區(qū)H3、H4乙酰化及H3K4三甲基化水平均發(fā)

9、生顯著改變,并能夠進(jìn)一步影響PRA/PRB比值,提示子宮平滑肌細(xì)胞H3、H4乙?；?、及H3K4甲基化均可通過(guò)調(diào)節(jié)PRA的表達(dá)改變PRA/PRB比值。細(xì)胞水平與組織水平實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果略有不同,尤其是在乙酰化的影響結(jié)果上,組織水平顯示乙?；趩?dòng)組和未啟動(dòng)組之間沒(méi)有明顯差異,但細(xì)胞水平卻顯示乙酰化確實(shí)可以使PRA、PR的表達(dá)量升高,這樣的結(jié)果可能是因?yàn)榻M織中的表觀遺傳是一個(gè)非常復(fù)雜的體系,而體外單純的藥物干預(yù)只能單因素的干擾乙酰化或者甲基化